Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Toxoplasma gondii estas intraĉela protozoa parazito kiu modulas la mikromedion de la sepsa gastiganto kaj povas esti rilata al la incidenco de cerba tumorkresko.En ĉi tiu studo, ni hipotezas, ke eksosoma miRNA-21 de Toxoplasma-infekto antaŭenigas kreskon de cerba tumoro.Ekzozomoj de Toxoplasma-infektita BV2-mikroglia estis karakterizitaj kaj internigo de U87-gliomĉeloj estis konfirmita.Eksosomaj mikroRNA-esprimprofiloj estis analizitaj uzante arojn de mikroRNA kaj microRNA-21A-5p asociitaj kun Toxoplasma gondii kaj tumorordigo.Ni ankaŭ esploris la mRNA-nivelojn de tumor-asociitaj genoj en U87-gliomaj ĉeloj ŝanĝante miR-21-nivelojn en eksosomoj kaj la efikon de eksosomoj sur homa U87-glioma ĉelo proliferado.En eksosomoj de U87-gliomĉeloj infektitaj kun Toxoplasma gondii, la esprimo de microRNA-21 estas pliigita kaj la agado de kontraŭtumoraj genoj (FoxO1, PTEN, kaj PDCD4) estas reduktita.BV2-derivitaj eksosomoj infektitaj kun Toxoplasma stimulas proliferadon de U87-gliomĉeloj.Eksozomoj stimulas kreskon de U87-ĉeloj en musa tumormodelo.Ni sugestas, ke pliigita eksosoma miR-21 en Toxoplasma-infektita BV2-mikroglia povas ludi gravan rolon kiel ĉelkresko-reklamanto en U87-gliomaj ĉeloj per subreguligo de kontraŭtumoraj genoj.
Oni taksas, ke pli ol 18,1 milionoj da kazoj de progresinta kancero estis diagnozitaj tutmonde en 2018, kun ĉirkaŭ 297 000 tumoroj de centra nervoza sistemo diagnozitaj ĉiujare (1,6% de ĉiuj tumoroj)1.Antaŭa esplorado montris, ke riskfaktoroj por evoluigado de homaj cerbaj tumoroj inkluzivas diversajn kemiajn produktojn, genealogian historion kaj jonigan radiadon de kapo terapia kaj diagnoza ekipaĵo.Tamen, la preciza kaŭzo de ĉi tiuj malignaĵoj estas nekonata.Proksimume 20% de ĉiuj kanceroj tutmonde estas kaŭzitaj de infektaj agentoj, inkluzive de virusoj, bakterioj kaj parazitoj3,4.Infektaj patogenoj interrompas la genetikajn mekanismojn de la gastiga ĉelo, kiel DNA-riparo kaj la ĉela ciklo, kaj povas konduki al kronika inflamo kaj damaĝo al la imunsistemo5.
Infektaj agentoj asociitaj kun homa kancero estas la plej oftaj viruspatogenoj, inkluzive de homaj papilomavirusoj kaj hepatito B kaj C virusoj.Parazitoj ankaŭ povas ludi eblan rolon en la evoluo de homa kancero.Pluraj parazitspecioj, nome Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis kaj Hymenolepis nana, estis implikitaj en diversaj specoj de homa kancero 6,7,8.
Toxoplasma gondii estas intraĉela protozoo kiu reguligas la mikromedion de sepsaj gastigaj ĉeloj.Oni taksas, ke ĉi tiu parazito infektas proksimume 30% de la monda loĝantaro, kio riskas la tutan loĝantaron9,10.Toxoplasma gondii povas infekti esencajn organojn, inkluzive de la centra nervosistemo (CNS), kaj kaŭzi gravajn malsanojn kiel mortiga meningito kaj encefalito, precipe en imunokompromititaj pacientoj9.Tamen, Toxoplasma gondii ankaŭ povas ŝanĝi la medion de la infektita gastiganto modulante ĉelkreskon kaj imunreagojn en imunkompetentaj individuoj, kondukante al la prizorgado de sensimptoma kronika infekto9,11.Interese, surbaze de la korelacio inter T. gondii tropezo kaj cerba tumoro-incidenco, kelkaj raportoj sugestas ke en vivo gastigas mediajn ŝanĝojn pro kronika T. gondii-infekto similas la tumormikromedion.
Eksozomoj estas konataj kiel interĉelaj komunikiloj, kiuj liveras biologian enhavon, inkluzive de proteinoj kaj nukleaj acidoj, de najbaraj ĉeloj16,17.Eksozomoj povas influi tumor-rilatajn biologiajn procesojn kiel ekzemple kontraŭ-apoptozo, angiogenezo, kaj metastazo en la tumormikromedio.Aparte, miRNAoj (miRNAs), malgrandaj ne-ĉifradaj RNAoj proksimume 22 nukleotidoj en longo, estas gravaj post-transskribaj genreguligistoj kiuj kontrolas pli ol 30% de homa mRNA tra la miRNA-induktita silentiga komplekso (miRISC).Toxoplasma gondii povas interrompi biologiajn procesojn kontrolante miRNA-esprimon en sepsaj gastigantoj.GastmiRNAoj enhavas gravajn signalojn por reguligado de gastigaj biologiaj procesoj por realigi la supervivstrategion de la parazito.Tiel, studi ŝanĝojn en la gastiganta miRNA-profilo sur infekto kun T. gondii povas helpi nin kompreni la interagadon inter la gastiganto kaj T. gondii pli klare.Efektive, Thirugnanam et al.15 sugestis ke T. gondii antaŭenigas cerban karcinogenezon ŝanĝante ĝian esprimon sur specifaj gastigaj miRNA'oj asociitaj kun tumorkresko kaj trovis ke T. gondii povas kaŭzi gliomojn en eksperimentbestoj.
Tiu studo temigas la ŝanĝon de eksosomal miR-21 en gastiga mikroglia infektita kun Toxoplasma BV2.Ni observis eblan rolon de ŝanĝita eksosoma miR-21 en la kresko de U87-gliomaj ĉeloj pro la reteno en la kerno de FoxO1/p27, kiu estas la celo de troesprimita miR-21.
Ekzozomoj derivitaj de BV2 estis akiritaj uzante diferencigan centrifugon kaj validigitaj per diversaj metodoj por malhelpi poluadon kun ĉelaj komponentoj aŭ aliaj vezikoj.SDS-poliakrilamida ĝelelektroforezo (SDS-PAGE) montris apartajn ŝablonojn inter proteinoj ĉerpitaj de BV2-ĉeloj kaj eksosomoj (Figuro 1A), kaj specimenoj estis taksitaj por la ĉeesto de Alix, kiu estis analizita per okcidenta makulo de eksosomaj proteinsignoj en.Alix-etikedado estis trovita en eksosomaj proteinoj sed ne en BV2-ĉelaj lisatproteinoj (Fig. 1B).Krome, purigita RNA de eksosomoj derivitaj de BV2 estis analizita uzante bioanalizilon.18S kaj 28S ribosomaj subunuoj malofte estis observitaj en la eksosoma RNA-migradpadrono, indikante fidindan purecon (Figuro 1C).Fine, dissenda elektrona mikroskopio montris ke la observitaj eksosomoj estis proksimume 60-150 nm en grandeco kaj havis tas-similan strukturon tipan de eksosome morfologio (Fig. 1D).
Karakterizado de eksosomoj derivitaj de BV2-ĉeloj.(A) Sekureca datuma paĝo.Proteinoj estis izolitaj de BV2-ĉeloj aŭ eksosomoj derivitaj de BV2.Proteinpadronoj malsamas inter ĉeloj kaj eksosomoj.(B) Analizo de okcidenta makulo de eksosoma signo (Alix).(C) Taksado de purigita RNA de BV2-ĉeloj kaj BV2 derivitaj eksosomoj uzante bioanalizilon.Tiel, 18S kaj 28S ribosomaj subunuoj en BV2-ĉeloj malofte estis trovitaj en eksosomal RNA.(D) Dissenda elektrona mikroskopio montris, ke eksosomoj izolitaj de BV2-ĉeloj estis negative makulitaj per 2% uranilacetato.Eksozomoj estas proksimume 60-150 nm en grandeco kaj tasformaj (Song kaj Jung, neeldonitaj datenoj).
Ĉela internigo de BV2-derivitaj eksosomoj en U87 homaj gliomĉeloj estis observita uzante konfokusan mikroskopion.PKH26-etikeditaj eksosomoj estas lokalizitaj en la citoplasmo de U87-ĉeloj.Nukleoj estis makulitaj per DAPI (Fig. 2A), indikante, ke BV2-derivitaj eksosomoj povas esti internigitaj de gastigaj ĉeloj kaj influi la medion de ricevantaj ĉeloj.
Internado de BV2-derivitaj eksosomoj en U87-gliomĉelojn kaj BV2-derivitajn eksosomojn infektitajn kun Toxoplasma RH induktis proliferadon de U87-gliomĉeloj.(A) Eksozomoj englutitaj de U87-ĉeloj mezuritaj per konfokusa mikroskopio.U87-gliomĉeloj estis kovataj kun eksosomoj etikeditaj kun PKH26 (ruĝa) aŭ sen kontrolo dum 24 horoj.La kernoj estis makulitaj per DAPI (blua) kaj tiam observitaj sub konfokusa mikroskopo (skalstango: 10 μm, x 3000).(B) U87-glioma ĉela proliferado estis determinita per ĉela proliferado-analizo.U87-gliomĉeloj estis traktitaj kun eksosomoj por la indikita tempo. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Student. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 per t-testo de Studento. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 akirita uzante t-teston de Studento.
Post konfirmi la internigon de BV2-derivitaj eksosomoj en U87-gliomaj ĉeloj, ni faris ĉelproliferajn provojn por esplori la rolon de BV2-derivitaj Toxoplasma-derivitaj ekzosomoj en la evoluo de homaj gliomĉeloj.Traktado de U87-ĉeloj kun eksosomoj de T. gondii-infektitaj BV2-ĉeloj montris, ke T. gondii-infektitaj BV2-derivaj eksosomoj kaŭzis signife pli altan proliferadon de U87-ĉeloj kompare kun kontrolo (Fig. 2B).
Krome, kresko de U118-ĉeloj havis la samajn rezultojn kiel U87, ĉar Toxoplasma stimulis eksosomojn kaŭzis la plej altajn nivelojn de proliferado (datenoj ne montritaj).Surbaze de ĉi tiuj datumoj, ni povas indiki, ke BV2-derivita Toxoplasma-infektitaj eksosomoj ludas gravan rolon en glioma ĉelproliferado.
Por esplori la efikon de Toxoplasma-infektitaj BV2-derivitaj eksosomoj sur tumora evoluo, ni injektis U87-gliomajn ĉelojn en nudajn musojn por ksenograft-modelo kaj injektis BV2-derivitajn eksosomojn aŭ RH-infektitajn BV2-derivitajn eksosomojn.Post kiam tumoroj evidentiĝis post 1 semajno, ĉiu eksperimenta grupo de 5 musoj estis dividita laŭ tumorgrandeco por determini la saman deirpunkton, kaj tumorgrandeco estis mezurita dum 22 tagoj.
En musoj kun la ksenograft-modelo U87, signife pli granda tumorgrandeco kaj pezo estis observitaj en la BV2-derivita RH-infektita eksosome grupo je la tago 22 (Fig. 3A, B).Aliflanke, ne estis signifa diferenco en tumorgrandeco inter la BV2-derivita eksosome grupo kaj la kontrolgrupo post eksosome traktado.Krome, musoj injektitaj kun gliomaj ĉeloj kaj eksosomoj vide montris la plej grandan tumoran volumon en la grupo de RH-infektitaj BV2-derivitaj eksosomoj (Fig. 3C).Tiuj rezultoj pruvas ke BV2-derivita Toxoplasma-infektitaj eksosomoj induktas gliomkreskon en musa tumormodelo.
Onkogenezo (AC) de BV2-derivitaj eksosomoj en U87 ksenotransplanta musmodelo.Tumorgrandeco (A) kaj pezo (B) estis signife pliigitaj en BALB/c nudaj musoj traktitaj kun RH-infektitaj eksosomoj derivitaj de BV2.BALB/c nudaj musoj (C) estis injektitaj subkutane kun 1 x 107 U87-ĉeloj suspenditaj en Matrigel-miksaĵo.Ses tagojn post injekto, 100 μg da BV2-derivitaj eksosomoj estis traktitaj en musoj.Tumorgrandeco kaj pezo estis mezuritaj en la indikitaj tagoj kaj post ofero, respektive. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
La datumoj montris, ke 37 miRNAs (16 troesprimitaj kaj 21 subesprimitaj) asociitaj kun imuneco aŭ tumora disvolviĝo estis signife ŝanĝitaj en mikroglia post infekto kun la Toxoplasma RH-trostreĉiĝo (Fig. 4A).Relativaj esprimniveloj de miR-21 inter ŝanĝitaj miRNA'oj estis konfirmitaj per realtempa RT-PCR en eksosomoj derivitaj de BV2, eksosomoj traktitaj kun BV2 kaj U87-ĉeloj.Esprimo de miR-21 montris signifan pliiĝon en eksosomoj de BV2-ĉeloj infektitaj kun Toxoplasma gondii (RH-trostreĉiĝo) (Fig. 4B).Relativaj esprimniveloj de miR-21 en BV2 kaj U87-ĉeloj pliiĝis post konsumado de ŝanĝitaj eksosomoj (Fig. 4B).La relativaj niveloj de miR-21-esprimo en la cerbaj histoj de tumoraj pacientoj kaj musoj infektitaj kun Toxoplasma gondii (ME49-trostreĉiĝo) estis pli altaj ol en kontroloj, respektive (Fig. 4C).Tiuj rezultoj korelacias kun diferencoj inter la esprimniveloj de antaŭviditaj kaj konfirmitaj mikroRNAoj en vitro kaj en vivo.
Ŝanĝoj en la esprimo de eksosomal miP-21a-5p en mikroglia infektita kun Toxoplasma gondii (RH).(A) Pruvas signifajn ŝanĝojn en siRNA asociita kun imuneco aŭ tumorevoluo post T. gondii RH-infekto.(B) Relativaj miR-21-esprimniveloj estis detektitaj per realtempa RT-PCR en BV2-derivitaj eksosomoj, BV2-traktitaj eksosomoj kaj U87-ĉeloj.(C) Relativaj miR-21-esprimniveloj estis trovitaj en la cerbaj histoj de tumoraj pacientoj (N = 3) kaj musoj infektitaj kun Toxoplasma gondii (ME49-trostreĉiĝo) (N = 3). *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Student. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Studento. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 akirita uzante t-teston de Studento.
Eksozomoj de RH-infektitaj BV2-ĉeloj kaŭzis kreskon de gliomoj en vivo kaj in vitro (Fig. 2, 3).Por detekti koncernajn mRNA-ojn, ni ekzamenis mRNA-nivelojn de kontraŭtumorcelaj genoj, forkhead-skatolo O1 (FoxO1), PTEN, kaj programitan ĉelmorton 4 (PDCD4) en U87-ĉeloj infektitaj kun eksosomoj derivitaj de BV2 aŭ RH BV2.Bioinformatika analizo montris ke pluraj tumor-rilataj genoj, inkluzive de la FoxO1, PTEN, kaj PDCD4 genoj, havas miR-2121,22 liglokojn.mRNA-niveloj de kontraŭtumorcelaj genoj estis reduktitaj en RH-infektitaj BV2-derivaj eksosomoj kompare kun BV2-derivaj eksosomoj (Fig. 5A).FoxO1 montris reduktitajn proteinajn nivelojn en RH-infektitaj BV2-derivitaj eksosomoj kompare kun BV2-derivitaj eksosomoj (Figuro 5B).Surbaze de ĉi tiuj rezultoj, ni povus konfirmi, ke eksosomoj derivitaj de RH-infektita BV2 subreguligas kontraŭ-onkogenajn genojn, konservante sian rolon en tumorkresko.
Toxoplasma RH-infektitaj BV2-derivitaj eksosomoj induktas subpremadon de kontraŭtumorgenoj en U87-gliomĉeloj per Toxoplasma RH-infektitaj BV2-derivitaj eksosomoj.(A) Realtempa PCR de FoxO1, PTEN kaj PDCD4-esprimo en eksosomoj derivitaj de T. gondii RH-infektita BV2 kompare kun PBS eksosomoj.β-aktina mRNA estis utiligita kiel kontrolo.(B) FoxO1-esprimo estis determinita per okcidenta blotting kaj densitometriaj datumoj estis statistike taksitaj per la programo ImageJ. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Student. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05 estis akirita per t-testo de Studento. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 akirita uzante t-teston de Studento.
Por kompreni la efikon de miP-21 en eksosomoj sur tumor-rilata genreguligo, U87-ĉeloj estis transfektitaj kun inhibitoro de miP-21 uzante Lipofectamine 2000 kaj la ĉeloj estis rikoltitaj 24 horojn post transfekto.FoxO1 kaj p27-esprimniveloj en ĉeloj transfektitaj kun miR-21-inhibitoroj estis komparitaj kun ĉeloj traktitaj kun BV2-derivaj eksosomoj uzante qRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfekto de la miR-21-inhibitoro en U87-ĉelojn signife subreguligis FoxO1 kaj p27-esprimon (FIG. 6).
RH-infektita eksosomal BV2-derivita miP-21 ŝanĝis FoxO1/p27-esprimon en U87-gliomĉeloj.U87-ĉeloj estis transfektitaj kun miP-21-inhibitoro uzante Lipofectamine 2000 kaj ĉeloj estis rikoltitaj 24 horojn post transfekto.FoxO1 kaj p27-esprimniveloj en ĉeloj transfektitaj kun miR-21-inhibitoroj estis komparitaj kun niveloj en ĉeloj traktitaj kun BV2-derivitaj eksosomoj uzante qRT-PCR (A, B).
Por eviti la imunreagon de la gastiganto, la Toxoplasma parazito transformas en histan kiston.Ili parazitas diversajn histojn, inkluzive de la cerbo, koro, kaj skeletmuskolo, dum la vivdaŭro de la gastiganto kaj modulas la imunreagon de la gastiganto.Krome, ili povas reguligi la ĉelan ciklon kaj apoptozon de gastigaj ĉeloj, antaŭenigante sian proliferadon14,24.Toxoplasma gondii ĉefe infektas gastigajn dendritajn ĉelojn, neŭtrofilojn, kaj monocitajn/makrofaggenliniojn, inkluzive de cerba mikroglia.Toxoplasma gondii induktas la diferencigon de makrofagoj de la M2-fenotipo, influas vundresanigon post patogeninfekto, kaj ankaŭ estas rilata al hipervaskularigo kaj granulomatoza fibrozo.Tiu kondutisma patogenezo de Toxoplasma infekto povas esti rilatita al signoj asociitaj kun tumorevoluo.La malamika medio reguligita fare de Toxoplasma povas simili la ekvivalentan antaŭkancero.Tial oni povas supozi, ke Toxoplasma infekto devus kontribui al la disvolviĝo de cerbaj tumoroj.Fakte, altaj indicoj de Toxoplasma infekto estis raportitaj en la serumo de pacientoj kun diversaj cerbaj tumoroj.Krome, Toxoplasma gondii povas esti alia kancerogena efektoro kaj agi sinergie por helpi aliajn infektajn kancerogenojn evoluigi cerbajn tumorojn.Ĉi-rilate, indas noti, ke P. falciparum kaj Epstein-Barr-viruso sinergie kontribuas al la formado de la limfomo de Burkitt.
La rolo de eksosomoj kiel reguligistoj en la kampo de kanceresplorado estis grandskale esplorita.Tamen, la rolo de eksosomoj inter parazitoj kaj infektitaj gastigantoj restas nebone komprenita.Ĝis nun, diversaj reguligistoj, inkluzive de kaŝitaj proteinoj, klarigis la biologiajn procezojn per kiuj protozoaj parazitoj rezistas gastigantan atakon kaj eternigas infekton.Lastatempe, ekzistas kreskanta koncepto ke protozo-rilataj mikrovezikoj kaj iliaj mikroRNA'oj interagas kun gastigaj ĉeloj por krei favoran medion por ilia supervivo.Tial, pliaj studoj estas necesaj por malkovri la rilaton inter ŝanĝitaj eksosomaj miRNA'oj kaj gliomĉelmultobliĝo.MikroRNA-ŝanĝo (aretgenoj miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 kaj miR-17-92) ligas al la STAT3-reklamanto en toksoplasmo-infektitaj homaj makrofagoj, estas reguligita kaj induktas kontraŭ. -apoptozo en respondo al Toxoplasma gondii infekto 29 .Toxoplasma infekto pliigas la esprimon de miR-17-5p kaj miR-106b-5p, kiuj estas asociitaj kun pluraj hiperproliferaj malsanoj 30 .Tiuj datenoj indikas ke gastigaj miRNA'oj reguligitaj per Toxoplasma infekto estas gravaj molekuloj por parazitsupervivo kaj patogenezo en gastiga biologia konduto.
Ŝanĝitaj miRNA'oj povas influi diversajn specojn de konduto dum la inico kaj progresado de malignaj ĉeloj, inkluzive de gliomoj: memsufiĉo de kreskosignaloj, sensentemo al kresk-inhibiciaj signaloj, apoptozo-evitado, senlima replika potencialo, angiogenezo, invado kaj metastazo, kaj inflamo.En gliomo, ŝanĝitaj miRNA'oj estis identigitaj en pluraj esprimo-profilaj studoj.
En la nuna studo, ni konfirmis altajn nivelojn de miRNA-21-esprimo en toxoplasmo-infektitaj gastigaj ĉeloj.miR-21 estis identigita kiel unu el la plej ofte troesprimitaj mikroRNA en solidaj tumoroj, inkluzive de gliomoj, 33 kaj ĝia esprimo korelacias kun la grado de gliomo.Akumulo de indico indikas ke miR-21 estas nova onkogeno kiu funkcias kiel kontraŭ-apoptoza faktoro en gliomkresko kaj estas tre troesprimita en histoj kaj plasmo de homcerbaj malignecoj.Interese, la malaktivigo de miR-21 en gliomaj ĉeloj kaj histoj ekigas la inhibicion de ĉela proliferado pro caspase-dependa apoptozo.Bioinformatika analizo de miR-21 antaŭdiritaj celoj rivelis multoblajn tumorsubpremantajn genojn asociitajn kun apoptozovojoj, inkluzive de programita ĉelmorto 4 (PDCD4), tropomiosino (TPM1), PTEN, kaj forkkapa skatolo O1 (FoxO1), kun la miR-2121 ligloko..22.38.
FoxO1, kiel unu el la transkripcifaktoroj (FoxO), estas engaĝita en la evoluo de diversaj specoj de homa kancero kaj povas reguligi la esprimon de tumorsubpremantgenoj kiel ekzemple p21, p27, Bim, kaj FasL40.FoxO1 povas ligi kaj aktivigi ĉelciklonhibitorojn kiel ekzemple p27 por subpremi ĉelkreskon.Krome, FoxO1 estas esenca efikilo de PI3K/Akt-signalado kaj reguligas multajn biologiajn procesojn kiel ekzemple ĉelcikloprogresado kaj ĉeldiferencigo per aktivigo de p2742-transskribo.
Konklude, ni kredas, ke eksosomal miR-21 derivita de Toxoplasma-infektita mikroglia povas ludi gravan rolon kiel kreskreguligilo de glioma ĉeloj (Fig. 7).Tamen, pliaj studoj estas necesaj por trovi rektan ligon inter eksosomal miR-21, ŝanĝita Toxoplasma infekto, kaj gliomkresko.Ĉi tiuj rezultoj estas atenditaj disponigi deirpunkton por studi la rilaton inter Toxoplasma infekto kaj la incidenco de gliomo.
Skema diagramo de la mekanismo de glioma (cerbo) karcinogenezo estas proponita en ĉi tiu studo.La aŭtoro desegnas en PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Ĉiuj eksperimentaj protokoloj en ĉi tiu studo, inkluzive de la uzo de bestoj, estis konformaj al la Normaj Etikaj Gvidlinioj de la Seulo Nacia Universitato pri Besto-Prizorgo kaj Uzanto-Komitato kaj estis aprobitaj de la Institucia Revizia Estraro de la Seulo Nacia Universitato-Lernejo de Medicino (IRB-numero SNU-). 150715).-2).Ĉiuj eksperimentaj proceduroj estis faritaj laŭ la rekomendoj de ARRIVE.
BV2 musmikroglia kaj U87 homaj gliomĉeloj estis kultivitaj en Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) kaj Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), respektive, ĉiu enhavante 10% feta bova serumo, 4 mM l- glutamino, 0,2 mM penicilino kaj 0,05 mM streptomicino.Ĉeloj estis kultivitaj en inkubatoro kun 5% CO2 je 37 °C.Alia glioma ĉellinio, U118, estis uzita por komparo kun U87-ĉeloj.
Por izoli eksosomojn de T. gondii-infektitaj RH kaj ME49-trostreĉoj, T. gondii-takizoitoj (RH-trostreĉiĝo) estis rikoltitaj el la abdomena kavo de 6-semajnaj BALB/c musoj injektitaj 3-4 tagojn antaŭe.Takizoitoj estis lavitaj trifoje per PBS kaj purigitaj per centrifugado en 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono)43.Por akiri takizoitojn de trostreĉiĝo ME49, BALB/c-musoj estis intraperitonee injektitaj kun 20 histokistoj kaj takizoita transformo en kistoj estis kolektita per lavado de la abdomena kavo en la 6-8-a tago post infekto (PI).Musoj infektitaj kun PBS.ME49-takizoitoj estis kreskigitaj en ĉeloj kompletigitaj kun 100 μg/ml penicilino (Gibco/BRL, Grand Island, NY, Usono), 100 μg/ml streptomicino (Gibco/BRL), kaj 5% feta bova serumo (Lonza, Walkersville, MD) .., Usono) je 37 °C kaj 5% karbondioksido.Post kultivado en Vero-ĉeloj, ME49-takizoitoj estis pasitaj dufoje tra 25 mezurila kudrilo kaj tiam tra 5 µm filtrilo por forigi derompaĵojn kaj ĉelojn.Post lavado, la takizoitoj estis resuspenditaj en PBS44.Histokistoj de Toxoplasma gondii-trostreĉiĝo ME49 estis konservitaj per intraperitonea injekto de kistoj izolitaj de la cerbo de infektitaj C57BL/6 musoj (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreio).La cerboj de ME49-infektitaj musoj estis rikoltitaj post 3 monatoj da PI kaj pikitaj sub mikroskopo por izoli kistojn.La infektitaj musoj estis konservitaj sub specialaj senpatogenaj kondiĉoj (SPF) ĉe la Seulo Nacia Universitato-Lernejo de Medicino.
Totala RNA estis ĉerpita el BV2-derivitaj eksosomoj, BV2-ĉeloj kaj histoj uzante la miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germanio) laŭ la instrukcioj de la produktanto, inkluzive de la kovadotempo por la elucia paŝo.La RNA-koncentriĝo estis determinita sur NanoDrop 2000 spektrofotometro.La kvalito de RNA-mikroaroj estis taksita per bioanalizilo Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederlando).
DMEM kun 10% eksosom-malriĉa FBS estis preparita per ultracentrifugado je 100,000g dum 16 horoj je 4 °C kaj filtrita tra 0.22 µm filtrilo (Nalgene, Rochester, NY, Usono).BV2-ĉeloj, 5 × 105, estis kultivitaj en DMEM enhavanta 10% eksosom-malplenigitan FBS kaj 1% antibiotikojn je 37 °C kaj 5% CO2.Post 24 horoj da kovado, takizoitoj de trostreĉiĝo RH aŭ ME49 (MOI = 10) estis aldonitaj al la ĉeloj kaj ne-invadaj parazitoj estis forigitaj ene de unu horo kaj replenigitaj per DMEM.Eksozomoj de BV2-ĉeloj estis izolitaj per modifita diferenciga centrifugo, la plej vaste uzita metodo.Resuspendu la eksosomen en 300 µl PBS por analizo de RNA aŭ proteino.La koncentriĝo de izolitaj eksosomoj estis determinita per BCA-proteina analizo-kompleto (Pierce, Rockford, IL, Usono) kaj spektrofotometro NanoDrop 2000.
Precipitaĵoj de BV2-ĉeloj aŭ eksosomoj derivitaj de BV2 estis lizitaj en PRO-PREP™ proteina ekstrakta solvo (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Koreio) kaj proteinoj estis ŝarĝitaj sur Coomassie brile bluaj makulitaj 10% SDS-poliakrilamidaj ĝeloj.Krome, proteinoj estis transdonitaj al PVDF-membranoj dum 2 horoj.Okcidentaj makuloj estis validigitaj uzante la antikorpon Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Usono) kiel eksosoma signo.HRP-konjugaciita kapra kontraŭmusa IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, Usono) kaj LAS-1000 plus lumineska bildanalizilo (Fuji Photographic Film, Tokio, Japanio) estis utiligitaj kiel sekundara antikorpo..Dissenda elektrona mikroskopio estis farita por studi la grandecon kaj morfologion de eksosomoj.Ekzozomoj izolitaj de BV2-ĉeloj (6.40 µg/µl) estis preparitaj sur karbon-tegitaj maŝoj kaj negative makulitaj kun 2% uranilacetato dum 1 min.La pretaj specimenoj estis observitaj ĉe akcela tensio de 80 kV uzante JEOL 1200-EX II (Tokio, Japanio) ekipita per ES1000W Erlangshen CCD-fotilo (Gatan, Pleasanton, CA, Usono).
BV2-derivaj eksosomoj estis makulitaj uzante la PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono) dum 15 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.U87-ĉeloj, 2×105, kun PKH26-etikeditaj eksosomoj (ruĝaj) aŭ neniuj eksosomoj kiel negativa kontrolo, estis kovataj je 37 °C dum 24 horoj en 5% CO2-inkubatoro.U87-ĉelaj kernoj estis makulitaj per DAPI (blua), U87-ĉeloj estis fiksitaj en 4% paraformaldehido dum 15 minutoj je 4 °C kaj poste analizitaj en Leica TCS SP8 STED CW-konfokusa mikroskopa sistemo (Leica Microsystems, Mannheim, Germanio).observebla.
cDNA estis sintezita de siRNA uzante Mir-X siRNA-unuan fadensintezon kaj SYBR qRT-PCR-ilaron (Takara Bio Inc., Shiga, Japanio).Realtempa kvanta PCR estis farita per la realtempa PCR-detekta sistemo iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, Usono) uzante enkondukojn kaj ŝablonojn miksitajn kun SYBR Premix.DNA estis plifortigita por 40 cikloj de denaturado je 95 °C dum 15 s kaj kalifikado je 60 °C dum 60 s.La datumoj de ĉiu PCR-reago estis analizitaj per la datuma analiza modulo de la optika sistema programaro iQ™5 (Bio-Rad).Relativaj ŝanĝoj en genesprimo inter elektitaj celgenoj kaj β-aktino/siRNA (kaj U6) estis kalkulitaj per la norma kurba metodo.La komencaj sekvencoj uzitaj estas montritaj en Tabelo 1.
3 x 104 U87-gliomĉeloj estis semitaj en 96-putetaj teleroj kaj miksitaj kun Toxoplasma-infektitaj ekzosomoj derivitaj de BV2 (50 μg/mL) aŭ nepulsaj eksosomoj derivitaj de BV2 (50 μg/mL) kiel kontroloj je 12, 18 kaj 36 horoj. .La imposto de proliferado de ĉeloj estis determinita uzante la Ĉelkalkula Ilaro-8 (Dojindo, Kumamoto, Japanio) (Suplementaj Figuroj S1-S3) 46 .
5-semajnaj inaj BALB/c nudaj musoj estis aĉetitaj de Orient Bio (Seongnam-si, Sud-Koreio) kaj konservitaj individue en sterilaj kaĝoj ĉe ĉambra temperaturo (22±2 °C) kaj humideco (45±15 °C).%) ĉe ĉambra temperaturo (22±2°C) kaj humideco (45±15%).12-hora lumciklo kaj 12-hora malhela ciklo estis faritaj sub SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Musoj estis hazarde dividitaj en tri grupojn de po 5 musoj kaj ĉiuj grupoj estis injektitaj subkutane per 400 ml da PBS enhavanta 1 x 107 U87 gliomĉelojn kaj kreskfaktoron reduktita BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, Usono).Ses tagojn post tumorinjekto, 200 mg da eksosomoj derivitaj de BV2-ĉeloj (kun/sen Toxoplasma infekto) estis injektitaj en la tumorejon.Dudek du tagojn post tumorinfekto, la tumorgrandeco de musoj en ĉiu grupo estis mezurita per kalibro tri fojojn semajne, kaj la tumorvolumeno estis kalkulita per la formulo: 0.5×(larĝo)×2×longo.
MicroRNA-esprim-analizo uzante miRCURYTM LNA miRNA-tabelon, 7-a generacio havas, mmu kaj rno-arojn (EXIQON, Vedbaek, Danio) kovrante 1119 bone karakterizitajn musojn inter 3100 homaj, musaj kaj rataj miRNA-kaptaj sondiloj.Dum ĉi tiu proceduro, 250 ĝis 1000 ng da totala RNA estis forigitaj de la 5′-fosfato per traktado kun bovida intesta alkala fosfatazo sekvita per etikedado kun Hy3 verda fluoreska tinkturfarbo.La etikeditaj provaĵoj tiam estis hibridigitaj ŝarĝante mikroarajn lumbildojn uzante hibridigan kamerilaron (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Usono) kaj hibridigan glitadkompleton (Agilent Technologies).Hibridado estis efektivigita dum 16 horoj je 56 °C, tiam la mikrotabeloj estis lavitaj laŭ la rekomendoj de la fabrikanto.La prilaboritaj mikrotaraj diapozitivoj tiam estis skanitaj uzante Agilent G2565CA mikrotaraj skanilsistemon (Agilent Technologies).Skanitaj bildoj estis importitaj per Agilent Feature Extraction programaro versio 10.7.3.1 (Agilent Technologies) kaj la fluoreskeca intenseco de ĉiu bildo estis kvantigita uzante la respondan GAL-dosieron de la modifita Exiqon-protokolo.Mikroaraj datumoj por la nuna studo estas deponitaj en la GEO-datumbazo sub aliĝnumero GPL32397.
Esprimprofiloj de maturaj eksosomaj miRNA'oj en mikroglia de RH aŭ ME49-trostreĉoj infektitaj kun Toxoplasma estis analizitaj uzante diversajn retajn ilojn.miRNAs asociitaj kun tumorevoluo estis identigitaj uzante miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) kaj filtritaj kun normaligita signalintenso (log2) pli granda ol 8.0.Inter miRNA'oj, diferencige esprimitaj miRNA'oj estis trovitaj esti pli ol 1,5-oble ŝanĝitaj per filtrilanalizo de miRNA'oj ŝanĝitaj per RH aŭ ME49-trostreĉoj infektitaj kun T. gondii.
Ĉeloj estis semitaj en ses-putaj teleroj (3 x 105 ĉeloj/puto) en opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, Usono) uzante Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Usono).La transfektitaj ĉeloj estis kultivitaj dum 6 horoj kaj tiam la medio estis ŝanĝita al freŝa kompleta medio.Ĉeloj estis rikoltitaj 24 horojn post transfekto.
Statistika analizo estis ĉefe farita per la t-testo de Student per Excel-programaro (Mikrosofto, Vaŝingtono, Usono).Por eksperimenta besta analizo, dudirekta ANOVA estis farita uzante Prism 3.0-programaron (GraphPad Software, La Jolla, CA, Usono). P-valoroj < 0.05 estis rigarditaj kiel statistike signifaj. P-valoroj < 0.05 estis konsiderataj statistike signifaj. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-valoroj <0.05 estis konsideritaj statistike signifaj. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-valoroj <0.05 estis konsideritaj statistike signifaj.
Ĉiuj eksperimentaj protokoloj uzataj en ĉi tiu studo estis aprobitaj de la Institucia Revizia Estraro de la Seulo Nacia Universitato-Lernejo de Medicino (IRB numero SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Laŭtaksa tutmonda kancero-incidenco kaj morteco en 2018: GLOBOCAN-fontoj kaj metodoj.Interpreto.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Sciigo pri la riskfaktoroj de cerbaj tumoroj kaj iliaj terapiaj intervenoj. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Sciigo pri la riskfaktoroj de cerbaj tumoroj kaj iliaj terapiaj intervenoj.Rashid, S., Rehman, K. kaj Akash, MS Revizio de riskfaktoroj por cerbaj tumoroj kaj gravaj terapiaj intervenoj. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Profunda kompreno de cerbaj tumoraj riskfaktoroj kaj terapiaj intervenoj.Rashid, S., Rehman, K. kaj Akash, MS Revizio de riskfaktoroj por cerbaj tumoroj kaj gravaj terapiaj intervenoj.Biomedicina scienco.Apotekisto.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virusaj interagoj en homaj orodigestaj kaj inaj genitalaj kanceroj: resumo de epidemiologia kaj laboratoria indico. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virusaj interagoj en homaj orodigestaj kaj inaj genitalaj kanceroj: resumo de epidemiologia kaj laboratoria indico.Kato I., Zhang J. kaj Sun J. Bakterio-virusaj interagoj en kancero de la homa gastrointestina vojo kaj ina genitala vojo: resumo de epidemiologiaj kaj laboratoriodatenoj. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用相互作用相互作用相互作用流消化道癌和女性生殖道癌中的细菌 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virusa interagado en homa buŝa kavdigesto kaj ina genera vojo: resumo de populara malsanscienco kaj laboratoria indico.Kato I., Zhang J. kaj Sun J. Bakterio-virusaj interagoj en homa gastrointestina kancero kaj ina genitala kancero: resumo de epidemiologiaj kaj laboratoriodatenoj.Kancero 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL De infekto ĝis kancero: Kiel DNA-tumorvirusoj ŝanĝas gastigan ĉelon centran karbonon kaj lipidan metabolon. Magon, KL & Parish, JL De infekto ĝis kancero: Kiel DNA-tumorvirusoj ŝanĝas gastigan ĉelon centran karbonon kaj lipidan metabolon.Mahon, KL kaj Parish, JL Fajro-infekto al kancero: kiel DNA-bazitaj tumorvirusoj ŝanĝas gastigan ĉelon centran karbonon kaj lipidan metabolon. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂谢 Magon, KL & Parish, JL De infekto ĝis kancero: kiel DNA-tumorvirusoj ŝanĝas gastigan ĉelon centran karbonon kaj lipidan metabolon.Mahon, KL kaj Parish, JL Fajras infekton al kancero: kiel DNA-tumorvirusoj ŝanĝas centran karbonon kaj lipidan metabolon en gastigaj ĉeloj.Malferma Biologio.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Katekolaj estrogenoj de skistosomoj kaj hepataj flukes kaj helminto-rilata kancero.fronto.varma interne.5, 444 (2014).