Giardia duodenum estas parazita organismo kiu kaŭzas giardiazon, intestan infekton precipe oftan en junaj infanoj kun klinikaj signoj de diareo.Ni antaŭe raportis, ke eksterĉela G. duodenalis ekigas la aktivigon de intraĉela oligomeriz-simila ricevilo 3 (NLRP3) liganta nukleotidojn kaj reguligas gastigantajn inflamajn respondojn per eksterĉela veziketo (EV) sekrecio.Tamen, la precizaj molekulaj padronoj de la patogen-rilata duodenokoka EV (GEV) implikita en tiu procezo kaj la rolo de la NLRP3-inflamsomo en giardiasis restas esti pliklarigitaj.
Rekombinaj eŭkariotaj esprimo-plasmidoj pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj alfa-7.3 giardins en GEV estis konstruitaj, transfektitaj en musajn primarajn peritoneajn makrofagojn, kaj detektitaj per mezurado de la inflamocela molekulo caspase-1.La p20-esprimnivelo estis ekzamenita..G. duodenalis alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj estis origine identigitaj per mezurado de NLRP3-inflamsomo (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 kaj caspase-1 p20), IL-sekrecio.1β-niveloj, apoptota makula proteino (ASC) oligomerigniveloj, kaj imunofluoreska lokalizo de NLRP3 kaj ASC.La rolo de la NLRP3 inflammasome en la patogeneco de G. duodenalis tiam estis taksita uzante musojn en kiuj NLRP3-aktivigo estis blokita (NLRP3 blokis musojn) kaj patologiaj ŝanĝoj en korpopezo, duodena parazita ŝarĝo kaj duodena histo estis monitoritaj.Krome, ni esploris ĉu hiardinoj alfa-2 kaj alfa-7.3 induktas IL-1β-sekrecion en vivo per la NLRP3-inflamasome kaj determinis la rolon de ĉi tiuj molekuloj en la patogeneco de G. duodenalis en musoj.
Alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj stimulas la aktivigon de la NLRP3-inflamsomo en vitro.Tio kaŭzis la aktivigon de p20-kaspase-1, pliiĝon en la esprimniveloj de NLRP3, por-IL-1β, kaj pro-caspase-1 proteinoj, signifa pliiĝo en IL-1β-sekrecio, la formado de ASA-punktoj en la citoplasmo, kaj la indukto de ASA-oligomerigo.NLRP3-inflamo Penila perdo pliseverigas la patogenecon de G. duodenalis en musoj.Musoj traktitaj kun kistoj per gavage de NLRP3-blokitaj musoj elmontris pliigitan nombron da trofozoitoj kaj severan damaĝon al la duodenaj viloj, karakterizitaj per nekrozaj kriptoj kun ŝrumpintaj kaj disbranĉigitaj.En vivaj eksperimentoj montris ke giardinoj alfa-2 kaj alfa-7.3 povas stimuli sekrecion de IL-1β per la NLRP3-inflamsome, kaj imunigo kun giardinoj alfa-2 kaj alfa-7.3 reduktis la patogenecon de G. duodenalis en musoj.
Kunigitaj, la rezultoj de ĉi tiu studo sugestas, ke giardia alfa-2 kaj alfa-7.3 kaŭzas suprenreguligo de gastiganta NLRP3-inflamo kaj reduktas la infektecon de G. duodenalis en musoj, kiuj estas promesplenaj celoj por malhelpi giardiasis.
Giardia duodenum estas eksterĉela protozoa parazito kiu vivas en la maldika intesto kaj kaŭzas 280 milionojn da kazoj de giardiazo kun diareo ĉiujare, precipe inter junaj infanoj en evolulandoj [1].Homoj infektiĝas per trinkakvo aŭ manĝaĵo poluita per M. duodenum-kistoj, kiuj poste eniras la stomakon kaj estas sekreciitaj en la stomakaj sukoj.Giardia duodenum trofozoitoj alkroĉiĝas al la duodena epitelio, kaŭzante naŭzon, vomadon, diareon, abdomenan doloron kaj malplipeziĝon.Individuoj kun imunomanko kaj mukoviskozo estas sentemaj al infekto.Infekto ankaŭ povas okazi per buŝa kaj anusa sekso [2].Drogoj kiel metronidazole, tinidazole kaj nitazoxanide estas la preferataj kuracaj elektoj por duodenaj infektoj [3].Tamen, ĉi tiuj kemioterapiaj drogoj kaŭzas adversajn kromefikojn kiel naŭzon, karcinogenezon kaj genotoksecon [4].Tial, pli efikaj strategioj devas esti evoluigitaj por malhelpi G. duodenalis-infekton.
Inflammasomoj estas klaso de citosolaj proteinkompleksoj kiuj estas parto de la denaska imuna respondo, helpante defendi kontraŭ patogeninvado kaj mediacii inflamajn respondojn [5].Inter tiuj inflamasomoj, nukleotid-liga oligomerigo (NOD) receptoro 3 (NLRP3) nukleotid-liga oligomerigo (NLRP3) nukleotid-liga oligomerigo (NLRP3) nukleotid-liga oligomerigo (NOD) estis amplekse studita ĉar ĝi povas esti detektita per diversaj patogen-/difekto-rilataj molekulaj ŝablonoj (PAMP/). DAMP), rekonas, aktivigas la denaskan imunsistemon.kaj reguligas intestan homeostazon en multaj inflamaj malsanoj [6,7,8].Ĝi konsistas el la padronrekono-receptoro (PRR) NLRP3, adaptilo apoptota makula proteino (ASC), kaj efektor prokaspase-1 aŭ prokaspase-11.La NLRP3-inflamsomo funkcias kiel gastiganto kontraŭ patogeninvado, kiel observite en Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], kaj Leishmania studoj.[11], sed ankaŭ estis raportite, ke aktivigo de la NLRP3-inflamsome limigas protektajn imunreagojn kaj plimalbonigas la progresadon de la malsano, ekzemple, en vermoj [12].Surbaze de niaj antaŭaj trovoj, ni raportis, ke eksterĉela G. duodenalis ekigas intraĉelan aktivigon de NLRP3-inflamo kaj modulas gastigajn inflamajn respondojn per sekreciado de eksterĉelaj vezikoj (EVs) [13].Tamen, la rolo de la NLRP3-inflamsomo en G. duodenalis-infekto en vivo restas determinita.
Giardins estis origine priskribitaj kiel strukturaj komponentoj de la G. duodenalis citoskeleto kaj ludas gravan rolon en trofozoitmotileco kaj epiteliĉelligiteco en la maldika intesto.Por pli bone adaptiĝi al la medio kaj pliigi sian patogenecon, G. duodenalis trofozoitoj evoluigis unikan citoskeletan strukturon konsistantan el 8 flageloj, 1 meza korpo, kaj 1 ventra disko [14].La trofozoitoj de Giardia duodeno uzas sian citoskeleton por penetri la supran maldikan inteston, aparte la duodenon, kaj alkroĉi al enterocitoj.Ili konstante migras kaj aliĝas al epiteliĉeloj uzante ĉelmetabolon.Tial, ekzistas proksima rilato inter ilia citoskeleto kaj virulenco.Giardinoj specifaj por Giardia duodeno estas komponentoj de la citoskeletstrukturo [15] kaj estas dividitaj en kvar klasojn: α-, β-, γ-, kaj δ-giardinoj.Estas 21 membroj de la familio α-giardin, ĉiuj el kiuj havas kalci-dependan kapablon ligi fosfolipidojn [16].Ili ankaŭ ligas la citoskeleton al la ĉelmembrano.En individuoj kun diareo kaŭzita de G. duodenalis, α-giardins estas tre esprimitaj kaj imunoreaktivaj dum infekto [17].Heterologaj vakcinoj bazitaj sur Giardia alfa-1 protektitaj kontraŭ giardiasis en musoj kaj estas eblaj kandidatoj antigenoj por vakcina evoluo [18].Alfa-8 giardin, lokalizita en la plasmomembrano kaj flageloj, sed ne en la ventra disko, plibonigas la motilecon kaj kreskorapidecon de trofozoitoj en G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin aliĝas al mikrotubulstrukturoj sur flageloj kaj influas la daŭrigeblecon de G. duodenalis [20].Alfa-11 giardine ĉeestas abunde dum la vivociklo, kaj troesprimo de alfa-11 giardine difektas G. duodenalis mem [21].Tamen, estas neklare ĉu alfa-2 giardine kaj alfa-7.3 giardine estas protektaj kontraŭ G. duodenalis-infekto kaj iliaj subestaj mekanismoj.
En ĉi tiu studo, rekombinaj eŭkariotaj esprimo-plasmidoj pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine kaj pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine estis transfektitaj en musajn primarajn peritoneajn makrofagojn por aktivigi gastiganton NLRP3.Inflamasome-celoj tiam estis ekzamenitaj.Ni ankaŭ taksis la rolon de la NLRP3-inflamsomo en la patogeneco de G. duodenalis, esploris ĉu alfa-2 kaj alfa-7,3 giardinoj induktas aktivigon de la NLRP3-inflamsomo en vivo, kaj determinis, ke ĉi tiuj du roloj de giardinoj en la patogeneco de G. duodenalis.Nia komuna celo estis evoluigi esperigajn celojn por la preventado de G. duodenalis-infekto.
Sovaĝa tipo (WT) C57BL/6 inaj musoj en aĝo de 5-8 semajnoj estis aĉetitaj de Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Lioning, Ĉinio).Musoj havis liberan aliron al akvo, ricevis steriligitan manĝaĵon kaj estis konservitaj en 12/12 hora lumo/malluma ciklo.Antaŭ infekto, musoj ricevis antibiotikojn laŭvole en trinkakvo kompletigita kun ampicilino (1 mg/mL), vankomicino (1 mg/mL), kaj neomicino (1.4 mg/mL) (ĉiuj aĉetitaj de Ŝanhajo, Ĉinio, artefaritaj organismoj) [22] ].].Musoj kiuj perdis la kapablon manĝi kaj trinki dum > 24 horoj kaj perdis ≥ 20% korpan pezon estis humane eutanigitaj per cervika dislokiĝo.
WB G. duodenalis trofozoitoj (American Type Culture Collection, Manassas, Usono) estis kompletigitaj per 12,5% feta bova serumo (FBS; Every Green, Zhejiang, Ĉinio) kaj 0,1% bova galo (Sigma-Aldrich, St. Missouri, Usono). ).Usono) sub mikroaerobaj kondiĉoj.Kunfluaj trofozoitoj estis kolektitaj sur glacio kaj trapasitaj en proporcio de 1:4 por plia reproduktado.
Giardia duodenum-kistoj estis induktitaj kiel priskribite antaŭe [23], trofozoitoj estis rikoltitaj en logaritma fazo kaj poste diluitaj per enkapsuligo indukta medio, pH 7.1 (modifita TYI-S-33) al fina koncentriĝo de 1 × 106 trofozoitoj/mL.galkoncentriĝo 0,05% meza).Trofozoitoj estis kultivitaj sub malaerobaj kondiĉoj je 37 °C ĝis la logaritma kreskofazo.Ŝanĝu la medion al kisto-indukta medio (pH 7.8; modifita TYI-S-33-medio kun 1% galkoncentriĝo) kaj kulturu G. duodenalis je 37 °C dum 48–96 horoj, dum kiuj la formaciaj kistoj estis observitaj sub mikroskopo.Post kiam la plej multaj el la trofozoitoj estis induktitaj por formi kistojn, la kulturmiksaĵo estis rikoltita kaj resuspendiita en sterila dejonigita akvo por lizi la ceterajn trofozoitojn.Kistoj estis nombritaj kaj stokitaj je 4 °C por postaj analizoj tra stomaka tubo en musoj.
Giardia eksterĉelaj vezikoj (GEV) estis riĉigitaj kiel priskribite antaŭe [13].Trofozoitoj en logaritma kreskfazo estis resuspenditaj en modifita TYI-S-33-medio preparita kun eksosom-malplenigita FBS (Biologiaj Industrioj, Beit-Haemek, Israelo) al fina koncentriĝo de 1 × 106 parazitoj/mL kaj kovitaj dum 12 horoj.estis izolitaj de la kultursupernatant per centrifugado je 2000 g dum 10 min, 10,000 g dum 45 min, kaj 100,000 g dum 60 min.Precipitaĵoj estis solvitaj en fosfato bufrita salo (PBS), kvantigitaj per BCA-proteina analizo-kompleto (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Usono) kaj stokitaj ĉe -80 ° C aŭ uzataj rekte por pliaj analizoj.
Primaraj musaj peritoneaj makrofagoj estis preparitaj kiel priskribite antaŭe [24].Mallonge, musoj (aĝaj 6-8 semajnoj) estis injektitaj (intraperitonee [ip]) kun 2.5 ml da 2.98% Difco-likva tioglikola medio (BD, Franklin Lakes, NJ, Usono) kaj nutritaj 3-4 palatoj.Pendado de makrofagoj estis kolektita el la abdomena kavo de musoj post eŭtanazio kaj centrifugata 3 fojojn je 1000 g dum 10 min.Rikoltitaj ĉeloj estis detektitaj per fluocitometrio uzante la CD11b-signon ĝis ĉela pureco estis >98%, tiam aldonitaj al 6-putoj ĉelkulturplatoj (4.5 x 106 ĉeloj/puto) kaj kovitaj kun 10% FBS (Bioindustrio) je 37 °C.kaj 5% CO2.
RNA estis ĉerpita de 1 × 107 trofozoitoj en 1 ml da TRIzol-reakciilo (Vazyme, Nankino, Ĉinio), genoma DNA estis ĉerpita de totala G. duodenalis RNA uzante MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Ĉinio) kaj komplementa DNA (cDNA) estis sintezita uzante MonScript RTIIII Super Mix (Monad) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
CDS-sekventinformoj por la celo G. duodenalis geno estis akiritaj de la NCBI GenBank.Uzu Primer 5.0 por desegni specifajn senjuntajn klonajn enkondukojn por ĉiu celgeno.La antaŭa enkonduko (5′-3′) konsistas el tri partoj: imbrikita sekvenco kun linearigita vektoro pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) kaj startkodonoj ATG kaj GNN (se la unua bazo ne estas G).Ĉi tio estas farita por plibonigi la efikecon de la esprimo.Krome, almenaŭ 16 bp kombinitaj bazoj (GC enhavo 40–60%/Tm ĉ. 55 °C).La inversa enkonduko (5′-3′) konsistas el du partoj, imbrikita sekvenco kun EcoRV-linearigita vektoro pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) kaj kombinita bazo de almenaŭ 16 bp.(krom la lastaj du haltoj).bazoj) kodono kiel ekzemple AA aŭ GA por permesi al rekombinaj plasmidoj esprimi siajn etikeditajn proteinojn).La primer-sekvencoj estas listigitaj en Tabelo 1 kaj estis sintezitaj de Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Ĉinio).
Celoj estis plifortigitaj uzante Pfu DNA-polimerazon (Tiangen, Pekino, Ĉinio) aŭ Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Pekino] Co., Ltd., Pekino, Ĉinio) uzante pretan G. duodenalis cDNA kiel ŝablonon.La eŭkariota esprimo vektora plasmido pcDNA3.1(+) estis linearigita kun restrikta enzimo EcoRV kaj defosforilata uzante Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearigitaj pcDNA3.1(+) fragmentoj kaj plifortigitaj celgenaj fragmentoj estis purigitaj per DNA-ĝela puriga ilaro (Tiangen) kaj kvantigitaj per Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).La pcDNA3.1(+) fragmento kaj ĉiu celgena fragmento estis rekombinitaj uzante MonClone ununuran asemblean klonan miksaĵon (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Ĉinio) kaj konfirmitaj per DNA-sekvencado uzante Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Ĉinio)..
Endotoxin-liberaj plasmidoj pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 estis generitaj uzante la SanPrep Endotoxin-libera Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).La koncentriĝo estis konservita super 500 ng/µl por certigi ke la EDTA en la elucia bufro ne malhelpis la transfektanalizon.Primaraj musaj peritoneaj makrofagoj estis kultivitaj en 6-putoj teleroj kun kompleta RPMI 1640 medio (Biologiaj Industrioj) dum 12 horoj, tiam la ĉeloj estis lavitaj 3 fojojn en varma PBS por forigi penicilinon kaj streptomicinon, kaj tiam en medio kompletigita kun kompleta medio.Endotoxin-liberaj plasmidoj pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2.5 μg) estis diluitaj en 125 μl de Opti-MEM reduktita serummedio (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Tiam 5 µl de Lipofectamine 2000 transfekta reakciilo (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) estis diluitaj en 125 µl da malalta serumo Opti-MEM-medio.Preparu liposom-DNA kompleksojn miksante la diluitan endotoksin-liberan plasmidon kun Lipofectamine 2000 kaj permesante al la miksaĵo stari ĉe ĉambra temperaturo dum 5 minutoj.Transdonu la kompleksojn aparte al ĉeloj en ĉiu puto kaj miksu malrapide.Post 4 horoj, la ĉelkulturmedio estis anstataŭigita per 2 ml da kompleta RPMI 1640 medio kaj kulturo estis daŭrigita dum 24 horoj.Freŝa ĉelkulturmedio estis aldonita al la ĉeloj kaj kovita dum diversaj tempopunktoj depende de la analizdezajno.
Proteinaj specimenoj de supernatantes kaj ĉelaj lisaĵoj estis preparitaj kiel priskribite antaŭe [25].Membranaj translokaj parametroj por pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-aktino, kaj His-etikedo estis 200 mA/90 min.Por interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minesoto, Usono), caspase-1 (p20) (Adipogen, Svislando) kaj NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Svislando) kaj 1:5000 celanta His-etikedon ( Amylet Scientific, Vuhano, Ĉinio) kaj β-aktino (Proteintech, Vuhano, Ĉinio).
Krucligo kun disuccinimide suberato (DSS) estis farita kiel priskribite antaŭe [26].Ĉeloj estis lavitaj 3 fojojn kun malvarma PBS kaj tute lizitaj per 27-mezurila kudrilo en 50 µl ASC-reagbufro (pH 8.0) enhavanta 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES kaj 125 mM NaHCO3.La miksaĵo estis centrifugata je 5000 g dum 3 minutoj kaj la buleto estis suturita per 10 µl DSS (25 mM en DMSO) kaj 40 µl ASC-reagbufro dum 30 minutoj je 37 °C.Post centrifugado je 5000 g dum 10 minutoj, la buleto estis solvita en solvaĵo de 40 µl da ASC-reagbufro kaj 10 µl da 6x protein-ŝarĝa bufro (TransGen, Pekino, Ĉinio), kaj tiam la solvo estis estingita ĉe ĉambra temperaturo dum 15. min., Tiam boli 10 minutojn.Proteinaj specimenoj tiam estis submetitaj al okcidenta makulado uzante primarajn kontraŭ-ASC-antikorpojn (Wanleibio, Shenyang, Ĉinio) kun diluoproporcio de 1:500.
Sekvante antaŭe priskribitan proceduron [13], ĉelkulturaj supernantoj estis rikoltitaj kaj sekrecio de la porinflama citokino IL-1β estis determinita uzante la musan IL-1 Beta ELISA-ilaron (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konvertu OD450nm-valorojn al proteinaj koncentriĝoj uzante la norman kurbon IL-1β.
Ĉeloj kovritaj per kovriloj estis milde lavitaj 3 fojojn en varma PBS, fiksitaj en hista ĉelfiksaĵo (Biosharp, Pekino, Ĉinio) dum 10 minutoj ĉe ĉambra temperaturo (RT), en 0,1% Triton X-Permeabilize je 100 (diluita en PBS; Biosharp). ) dum 20 minutoj ĉe ĉambra temperaturo kaj bloku en 5% bova serumalbumino (en PBS) dum 2 horoj ĉe ĉambra temperaturo.Ĉeloj tiam estis kovataj dum la nokto je 4 °C kun primaraj antikorpoj kontraŭ ASC (1:100 diluo) aŭ NLRP3 (1:100 diluo), respektive, kaj Cy3 etikedita kapro kontraŭ-kuniklo IgG (H+L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, Usono) aŭ FITC-konjugaciita kaprino kontraŭmusa IgG (1:400; Earthox) dum la nokto je 37 °C en la mallumo dum 1 horo.La kernoj estis makulitaj per Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Ĉinio) dum 5 minutoj kaj observitaj sub fluoreskeca mikroskopo (Olympus Corporation, Tokio, Japanio).
Musoj estis dividitaj en kvar grupojn (n = 7 en ĉiu grupo): (i) PBS-traktita negativa kontrolgrupo (PBS nur; gavu 100 µl/muso PBS sekvita per ĉiutaga intraperitonea injekto 100 µl/muso PBS 3 horojn poste)., senĉese dum 7 tagoj);(ii) negativa kontrolgrupo traktita kun MCC950-inhibitoro [27] (100 µl/muso per PBS gavage, 3 horojn poste, 10 mg/kg korpopezo [BW] MCC950 [en PBS] estis administrita intraperitonee ĉiutage, daŭro 7 tagojn);(iii) G. duodenalis kisto-infekta grupo (1.5 x 106 kistoj/muso per gavage, 3 horojn poste, 100 μl/muso PBS intraperitonee administrita ĉiutage dum 7 tagoj);(iv) G. duodenalis-kisto kombinita infekta grupo MCC950-inhibitoro-traktado-grupo (1.5 × 106 kistoj/muso per gavage, 10mg/kg korpopezo MCC950 intraperitonee ĉiutage dum 7 tagoj je 3h).La korpa pezo de ĉiu muso estis monitorita ĉiutage kaj ĉiuj musoj estis eutanigitaj en la 7-a tago.Rikoltita duodeno (3 cm longa) estis tranĉita en malgrandajn pecojn en 1 ml PBS, kistoj estis detruitaj dum la nokto en PBS je 4 °C, kaj G. duodenalis trofozoitoj.Freŝa duodeno (1 cm longa) estis izolita por hematoksilino kaj eozino (H&E) makulado.
Musoj estis dividitaj en du grupojn: (i) MOCK-kontrolgrupo kaj (ii) MCC950-inhibitogrupo.Estis kvin traktadoj en ĉiu grupo (n = 7/traktada grupo): (i) PBS-traktado negativa kontrolo-grupo (PBS nur; 100 µl/muso PBS, intramuskola (IM) injekto (tibialis antaŭa) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmida negativa kontrolo-grupo (100 µg/musa DNA, per intramuskola injekto) (iii) G. duodenalis kist-infekto-pozitiva kontrolgrupo (1.5 x 106 kistoj/muso, per gavage) (iv) a; grupo traktita kun plasmido pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/musa DNA, per intramuskola injekto), kaj (v) grupo traktita kun plasmido pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 μg/muso). DNA, post 12 horoj da trairejo, musoj en la grupo de inhibitoro de MCC950 ricevis ĉiutagan intraperitonean injekton de MCC950 (10 mg/kg korpopezo) dum 7 tagoj, dum musoj en la grupo MOCK ricevis egalan volumenon de PBS-traktado.Sangaj specimenoj estis. kolektitaj de la okulgloboj musoj kaj lasitaj dum la nokto je 4 °C Serumspecimenoj estis izolitaj uzante enzim-ligitajn imunosorban analizon (ELISA) por kaj mezuradoj de IL-1β-niveloj.
Tridek kvin musoj estis dividitaj en kvin grupojn (n=7/grupo).Grupo 1 estis negativa kontrolgrupo traktita kun PBS: musoj ricevis 100 μl da PBS intramuskle kaj 3 tagojn poste per gavage.Grupo 2 estas pozitiva kontrolgrupo infektita kun G. duodenalis-kistoj: musoj estis injektitaj per 100 μl da PBS, kaj 3 tagojn poste 1.5 x 106-kistoj/muso estis injektitaj intragastre.Tria grupo - plasmida imunigo kun pcDNA3.1(+) en kombinaĵo kun kontrolgrupo por duodena kisto-infekto: musoj ricevis 100 μg da plasmida DNA pcDNA3.1(+)(im) buŝe, 1.5×106 kistoj/muso 3 por pluraj tagoj.Grupoj 4 kaj 5 estis rekombinaj pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino-plasmido aŭ pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardino-plasmido en kombinaĵo kun G. duodenalis-kisto-infekto.Eksperimenta grupo: musoj ricevis 100 µg da pcDNA3.1(+)-giardina plasmida DNA (im), tiam 3 tagojn poste, 1.5 × 106 kistoj/muso estis injektitaj per gavage.La korpopezo de ĉiu muso estis monitorita post la enkonduko de la G. duodenalis-kisto tra la tubo.Freŝa duodeno estis kolektita por parazitaj ŝarĝmezuradoj kaj HE-makula analizo.
Histopatologiaj ŝanĝoj estis analizitaj laŭ antaŭe publikigita proceduro [30].Freŝa duodeno estis fiksita per histoĉela fiksaĵo, enigita en parafino, tranĉita en 4 μm sekciojn, makulita per H&E kaj analizita sub lummikroskopo.Reprezentaj patologiaj ŝanĝoj en sep histosekcioj de sep sendependaj musoj estis taksitaj de patologiisto nekonscia pri la traktado kaj estis kaptitaj ĉe 200x pligrandigo.La longo de la viloj kaj la profundo de la kriptoj estis mezuritaj laŭ la antaŭe priskribitaj metodoj.
La rezultoj in vitro kaj in vivo estis akiritaj triope.Grafikaĵoj estis generitaj uzante GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Usono).Diferencoj inter du grupoj estis analizitaj per t-testo, dum diferencoj inter ≥3 grupoj estis analizitaj per unudirekta analizo de varianco (ANOVA) uzante SPSS-programaron (versio 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, Usono).Datenoj estis analizitaj por homogeneco de varianco uzante la teston de Levene sekvitan de la post hoc testo de Bonferroni (B).Signifo estas esprimita kiel P<0.05, P<0.01, kaj P<0.001 (ne signifa [ns]) (P>0.05).
Nia antaŭa analizo de GEV-proteomiko en la Kioto Enciklopedio de Genoj kaj Genomoj (KEGG) montris, ke multaj celoj povas esti implikitaj en la aktivigo de inflamaj signalaj vojoj [13].Ni elektis du esperigajn celojn, alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj, plifortigas ĉi tiujn molekulojn kaj uzas ilin por konstrui la eŭkariotan esprimvektoron pcDNA3.1(+).Post sekvencado, rekombinaj pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj alfa-7.3 giardin-esprimplasmidoj estis transfektitaj en primarajn musajn peritoneajn makrofagojn, kaj la kaspase-1 p20-signatura proteino de inflamo (fragmento de aktivigita caspase-1) estis identigita. kiel klarigado de ŝlosilaj molekuloj, kiuj povas ekigi inflamon.La rezultoj montris ke alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj povas indukti p20-kaspase-1-esprimon similan al GEV.Neniu efiko al caspase-1-aktivigo estis trovita en la netraktita negativa kontrolo (PBS nur) kaj plasmida kontrolo pcDNA3.1(+) (Figuro 1).
Mezurado de p20-kaspase-1-aktivigo de pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj.Rekombinaj eŭkariotaj esprimoplasmidoj pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj (super ĉiu leno) estis transfektitaj en primarajn musajn peritoneajn makrofagojn kaj kultursupernatantes estis rikoltitaj 24 horojn poste.Okcidenta makulado estis uzita por mezuri esprimnivelojn de la signatura caspase-1 p20 inflamasome proteino.La PBS-nur-trakta grupo (leno C) kaj la pcDNA3.1(+) monoterapia grupo (pcDNA3.1-leno) estis uzataj kiel negativa kontrolo, kaj la GEV-kuraca grupo estis uzata kiel pozitiva kontrolo.Esprimo de la rekombina proteino estis konfirmita detektante histidinetikedon en ĉiu proteino, kaj la atendataj proteingrupoj estis alfa-2 giardine (38.2 kDa) kaj alfa-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum eksterĉelaj vezikoj, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearigita vektoro, SUP, supernatant
Determini ĉu alfa-2 giardine kaj alfa-7.3 giardine induktas p20-kaspase-1-esprimon kaj ludas rolon en aktivigado de la gastiganta NLRP3-inflama respondo, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine kaj pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin estis transfektita en primarajn musajn peritoneajn makrofagojn kun rekombina plasmida DNA, kaj niveloj de esprimo, lokalizo kaj oligomerigo de la ŝlosilaj inflamaj proteinoj NLRP3 estis determinitaj.En ĉi tiu eksperimento, GEV estis uzata kiel la pozitiva kontrolgrupo, kaj la senkuraca grupo (PBS nur) aŭ la pcDNA3.1(+) transfekta terapiogrupo estis la negativa grupo.La rezultoj montris ke, kiel en la GEV-grupo, rekombina plasmida DNA de giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 kaj giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 rezultigis suprenreguligo de NLRP3, pro-IL-1β kaj aktivigo de procaspase-1 kaj caspase-1 (Fig. 2a).Krome, ambaŭ giardinoj induktis signifan IL-1β-sekrecion (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giardino: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Figuro 2b).La plej multaj ASC-proteinoj estis monomeraj en la sentrakta grupo aŭ en la terapiogrupo transfektita kun la pcDNA3.1(+) plasmido, kontraste al pcDNA3.1(+)-alfa-2 aŭ pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardino.ASC-oligomerigo okazis en la rekombina plasmida DNA de la GEV-pozitiva kontrolgrupo aŭ grupo, montrante oligomeran formon (Figuro 2c).Ĉi tiuj antaŭaj datumoj sugestas, ke alfa-2 giardine kaj alfa-7,3 giardine povas stimuli NLRP3-inflaman aktivigon.Postaj imunofluoreskaj studoj de la lokalizo de ASC kaj NLRP3 montris ke en la negativa kontrolgrupo, la ASC-proteino estis disigita ĉie en la citoplasmo kaj aperis kiel punktosignalo sur stimulo de pcDNA3.1(+)-alfa-2 kun giardino aŭ pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardina grupo aŭ GEV-pozitiva kontrolo-grupo (Figuro 2d).En la negativa kontrolo kaj plasmid-traktita pcDNA 3.1 grupoj, la NLRP3-proteina signalo ne estis detektita, dum fluoreska signalpunkto en respondo al pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino aŭ pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 estis detektita..giardino troviĝas en la citoplasmo aŭ sur stimulado de la HEV (Fig. 2e).Tiuj datenoj plue pruvas ke G. duodenalis giardin alfa-2 kaj giardin alfa-7.3 aktivigas la NLRP3-inflamsomon en musaj primaraj peritoneaj makrofagoj.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin kaj pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin aktivigas la NLRP3-inflamsomon en musaj peritoneaj makrofagoj.Transfektu la rekombinajn eŭkariotajn esprimoplasmidojn pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin kaj pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin en primarajn murajn peritoneajn makrofagojn kaj ĉelojn, aŭ rikoltu la supernatantecon ene de 24 h por analizo de esprimo, oligomerigo. , sekrecio.kaj lokalizo de ŝlosilaj inflamaj proteinoj.La PBS-nur (C) grupo kaj la pcDNA3.1(+) ununura traktada grupo estis uzataj kiel negativa kontrolo, kaj la GEV-kuraca grupo estis uzata kiel la pozitiva grupo.a Ŝlosilaj inflamaj proteinoj NLRP3, inkluzive de NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, kaj p20 caspase-1, estis detektitaj per okcidenta makulado.b La niveloj de sekrecio de IL-1β en la supernatantes estis determinitaj per enzim-ligita imunosorbenta analizo (ELISA).Diferencoj inter kontrolo kaj eksperimentaj grupoj estis analizitaj per unudirekta analizo de varianco (ANOVA) uzante SPSS-programaron version 22.0.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn inter grupoj **P<0.01 kaj ***P<0.001.c ASC-oligomerigaj niveloj en buletoj estis determinitaj per DSS-kruciga analizo, dum ASC-niveloj en ĉelaj lizatoj estis uzataj kiel ŝarĝa kontrolo.d Bildigo de ISC-lokigo uzante imunofluoreskecon.e Immunofluoreskeco estis uzita por bildigi la lokalizon de NLRP3.ASC, apoptota makul-simila proteino;IL, interleukin;NLRP3, nukleotid-liganta oligomeriz-simila ricevilo 3;ns, ne signifa (P > 0.05)
Kaj G. duodenalis kaj la GEVoj kiujn ĝi sekrecias aktivigas la NLRP3-inflamsomon kaj reguligas mastro-inflamajn respondojn en vitro.Tiel, la rolo de la NLRP3-inflamsome en la patogeneco de G. duodenalis restas neklara.Por esplori ĉi tiun aferon, ni desegnis eksperimenton inter musoj infektitaj kun G. duodenalis-kisto kaj musoj infektitaj kun G. duodenalis-kisto + MCC950-inhibitortraktado kaj komparis NLRP3-inflamsoman esprimon kiam infektite kun G. duodenalis-kisto.Detala skemo de la eksperimento estas montrita en Fig. 3a.Ŝanĝoj en korpa pezo de musoj en malsamaj traktaj grupoj estis monitoritaj dum 7 tagoj post infekto kun kistoj, kaj la rezultoj estas montritaj en Fig. 3b.Kompare kun la grupo traktita kun pura PBS, la rezultoj montris ke (i) la korpa pezo de musoj infektitaj kun G. duodenalis kisto malpliiĝis de tago 3 al tago 7 post infekto;(ii) traktado kun la inhibilo MCC950 havis neniun signifan efikon sur la korpa pezo de la musoj..Kompare kun la ununura infekta grupo, la BW de la duodena infekta grupo traktita kun MCC950 malpliiĝis je diversaj gradoj (Tago 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Tago 2: ANOVA, F(3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001 Tago 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010 Tago 4: ANOVA, F (3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0.6497, P=0.0645: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175: ANOVA, F(3, 24) = 2.893;Ĉi tiuj datumoj pruvas, ke la NLRP3-inflamsomo protektas musojn kontraŭ grava malplipeziĝo en la fruaj stadioj (2-4 tagoj) de duodena infekto.Ni tiam celis detekti G. duodenalis trofozoitojn en duodena lava fluidaĵo kaj la rezultoj estas montritaj en Figuro 3c.Kompare al la grupo de infektaj kistoj de G. duodenalis, la nombro da trofozoitoj en la duodeno signife pliiĝis post blokado de la NLRP3-inflamsomo (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Duodenaj histoj makulitaj per HE montris, kompare kun negativa kontrolo traktita kun PBS kaj MCC950 sole: (i) G. duodenalis-kisto-infekto rezultigis damaĝon al la duodenaj viloj (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488. ) kaj kripto atrofio (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodeno de musoj infektitaj kun G. duodenalis-kistoj kaj traktitaj kun MCC950-inhibitoroj.duodenaj viloj estis difektitaj kaj mortaj (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) kun atrofio kaj kripta branĉiĝo (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d-). f) .Tiuj rezultoj indikas ke la NLRP3-inflamsomo ludas rolon en reduktado de la patogeneco de G. duodenalis.
Rolo de NLRP3-inflamsome en Giardia duodenum-infekto.Musoj estis gavaj (iv) kun duodenokokaj kistoj kaj tiam traktitaj kun aŭ sen MCC950 (ip).Unuopaj traktaj grupoj kun PBS aŭ MCC950 estis uzataj kiel kontroloj.Eksperimenta grupo kaj kuraca reĝimo.b La korpa pezo de musoj en ĉiu el la diversaj kuracgrupoj estis monitorita dum 7 tagoj.La diferenco inter la infekta grupo de G. duodenalis kaj la infekta traktado de G. duodenalis + MCC950 estis analizita per t-testo uzante SPSS-programaron version 22.0.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn ĉe *P<0.05, **P<0.01, aŭ ***P<0.001.c Parazita ŝarĝo estis determinita nombrante la nombron da trofozoitoj en duodena lavlikvaĵo.La diferenco inter la infekta grupo de G. duodenalis kaj la infekta traktado de G. duodenalis + MCC950 estis analizita per t-testo uzante SPSS-programaron version 22.0.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn ĉe *P < 0.05.d Hematoksilino kaj eozino (H&E) makulaj rezultoj de duodena histopatologio.Ruĝaj sagoj indikas difekton en la vilo, verdaj sagoj indikas difekton en la kriptoj.Skalstango: 100 µm.e, f Statistika analizo de duodena vilo-alteco kaj musa kripto-alteco.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn ĉe *P<0.05 kaj **P<0.01.La rezultoj estas prenitaj de 7 sendependaj biologiaj eksperimentoj.BW, korpa pezo;ig, intragastra livera vojo;ip, intraperitoneala livera vojo;ns, ne signifa (P > 0,05);PBS, fosfato bufrita salo;WT, sovaĝa tipo
La sekrecio de IL-1β estas markostampo de inflamo-aktivigo.Por determini ĉu G. duodenalis alfa-2 giardine kaj alfa-7.3 giardine aktivigas la NLRP3-gastigan inflammasomon en vivo, ni uzis netraktitajn WT-musojn (sham grupo) kaj NLRP3-inflamsome-blokitaj musoj (MCC950 inhibiciis traktan grupon).Detala skemo de la eksperimento estas montrita en Fig. 4a.Eksperimentaj grupoj konsistis el musoj traktitaj kun PBS, G. duodenalis-kistotraktado per gavage, intramuskola injekto de pcDNA3.1, kaj intramuskola injekto de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino aŭ pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine.En la 7-a tago post intramuskola administrado de la rekombina plasmido, serumo estis kolektita kaj la nivelo de IL-1β en ĉiu grupo estis determinita.Kiel montrite en Figuro 4b, en la MOCK-grupo: (i) kompare kun la PBS-grupo, pcDNA3.1-traktado havis neniun signifan efikon al IL-1β-sekrecio (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), tamen, IL-β-sekrecio estis signife levita en la grupo de kisto G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardino kaj pcDNA3.1- Intramuskola injekto de alfa-7.3 giardine signife pliigis serumajn IL-1β-nivelojn (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine induktis altajn nivelojn de IL -1β-sekrecio en la pcDNA3.1-alfa-2 giardine intramuskola injekta grupo (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Kompare kun ĉiu grupo en la MCC950-trakta grupo kaj la MOCK-grupo: (i) IL-1β-sekreciaj niveloj en la PBS-kontrolgrupo kaj la pcDNA3.1-kontrolgrupo malpliiĝis certagrade post blokado de la MCC950-inhibitoro, sed la diferenco ne estis. signifa (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) post blokado de MCC950., IL-1β-sekrecio estis signife reduktita en la kisto-infektita grupo de G. duodenalis, la pcDNA3.1-alfa-2 giardina grupo, kaj la pcDNA3.1-alfa-7.3 giardingrupo (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540 , P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (9, 58). ) = 3,540, P = 0,0164).Tiuj rezultoj indikas ke alfa-2 giardine kaj alfa-7.3 giardine mediacias la aktivigon de la NLRP3-inflamsome en vivo.
pcDNA3.1(+)-giardinoj aktivigas la NLRP3-gastigan inflamasomon en vivo.Musoj estis imunigitaj (IM) kun rekombina eŭkariota esprimo plasmido pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino aŭ pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardino kaj tiam traktitaj kun MCC950 (ip; MCC950-grupo) aŭ ne (manipula grupo). ).La PBS aŭ pcDNA3.1(+) Plasmida traktada grupo estis uzata kiel negativa kontrolo, la G. duodenalis-kisto-traktada grupo estis uzata kiel pozitiva kontrolo.Eksperimenta grupo kaj kuraca reĝimo.b Serumaj niveloj de IL-1β en musoj estis mezuritaj en la tago 7 per ELISA-analizo.Diferencoj inter grupoj en la MOCK-grupo estis analizitaj per unudirekta ANOVA, kaj diferencoj inter la MOCK-grupo kaj la MCC950-grupo estis analizitaj per la t-testo de SPSS-programa versio 22.0.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn inter traktaj grupoj en la MOCK-grupo, *P<0.05 kaj ***P<0.001;dolaraj signoj ($) indikas signifajn diferencojn inter ĉiu grupo en la MOCK-grupo kaj la MCC950-grupo ĉe P<0.05.Rezultoj de sep sendependaj biologiaj eksperimentoj.i, intramuskola injekto, ns, ne signifa (P > 0.05)
Por esplori la efikon de alfa-2 kaj alfa-7.3 giardino-mediaciita aktivigo de la NLRP3-gastiganto inflammasome sur G. duodenalis infekteco, ni uzis WT C57BL/6 musojn kaj injektis alfa-2 giardino kaj alfa-7.3 giardino.la plasmido estis injektita intramuskole, post 3 tagoj tra la stomaka tubo de la kisto de G. duodenalis, post kio la musoj estis observitaj dum 7 tagoj.Detala skemo de la eksperimento estas montrita en Fig. 5a.La korpa pezo de ĉiu muso estis mezurita ĉiutage, specimenoj de freŝa duodena histo estis kolektitaj en la 7-a tago post administrado tra stomaka tubo, la nombro da trofozoitoj estis mezurita, kaj histopatologiaj ŝanĝoj estis observitaj.Kiel montrite en Figuro 5b, kun kreskanta nutra tempo, la BW de musoj en ĉiu grupo iom post iom pliiĝis.La MT de musoj komencis malpliiĝi en la 3-a tago post intragastra administrado de G. duodenalis-kistoj, kaj tiam iom post iom pliiĝis.Aktivigo de la NLRP3-inflamsome induktita per intramuskola injekto de alfa-2 giardine kaj alfa7.3 giardine signife mildigis malplipeziĝon en musoj (Tago 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Tago 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Tago 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Tago 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 Tago 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Tago 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 Tago 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine; , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Tago 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Tago 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Tago 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Tago 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Tago 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Tago 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Tago 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).La parazita ŝarĝo estis taksita en la duodeno (Fig. 5c).Kompare kun la netraktita pozitiva kontrolo kaj la grupo injektita per la malplena pcDNA3.1-vektoro, la nombro da trofozoitoj de G. duodenalis estis signife reduktita en la grupoj injektitaj per α-2 giardino kaj α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P<0.0001).Krome, giardine alfa-7.3 estis pli protekta en musoj ol giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).La rezultoj de HE-makulado estas montritaj en fig.5d–f.Musoj injektitaj per alfa-2 giardine kaj alfa-7.3 giardine havis malpli da duodenaj histaj lezoj, manifestitaj per vilo-damaĝo, kompare kun musoj injektitaj per G. duodenalis kaj musoj injektitaj per G. duodenalis en kombinaĵo kun malplena pcDNA3-vektoro .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 aŭ P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0028 aŭ P = 0.0055) kaj reduktita kripto-atrofio (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 aŭ P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 aŭ P = 0,0191).Tiuj rezultoj indikas ke alfa-2 giardine kaj alfa-7,3 giardine reduktas la infektecon de G. duodenalis aktivigante la NLRP3-inflamsomon en vivo.
Rolo de pcDNA3.1(+)-giardins en G. duodenalis-infekto.Musoj estis imunigitaj (IM) kun rekombinaj eŭkariotaj esprimo-plasmidoj pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine aŭ pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine kaj tiam defiitaj kun G. duodenalis-kistoj (ig).La PBS-grupo kaj la pcDNA3.1(+) + duodena kisto-traktada grupo estis uzataj kiel negativaj kontrolgrupoj, kaj la duodena kisto-traktada grupo estis uzata kiel pozitiva kontrolgrupo.Eksperimenta grupo kaj kuraca reĝimo.b La MT de musoj en ĉiu el la diversaj traktaj grupoj estis monitorita dum 7 tagoj post defio.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn inter grupoj en la grupo G. duodenalis kaj la grupo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardino, *P <0.05, **P <0.01, kaj ***P <0.001;la dolara signo ($) indikas signifan diferencon inter ĉiu grupo de G. duodenalis kaj la pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine grupo, $$P<0.01 kaj $$$P<0.001.c Parazita ŝarĝo estis determinita nombrante la nombron da trofozoitoj en 1 ml da duodena lavado el la duodeno (3 cm longa) kaj esprimita kiel la nombro da parazitoj po cm da duodeno.Diferencoj inter la G. duodenalis infekta grupo, la pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine-grupo, kaj la pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine-grupo estis analizitaj per unudirekta ANOVA uzante SPSS-programaron version 22.0.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn ĉe **P<0.01 kaj ***P<0.001.d Histopatologiaj ŝanĝoj en la duodeno.Ruĝaj sagoj indikas difekton en la vilo, verdaj sagoj indikas difekton en la kriptoj.Skalstango: 100 µm.e, f Statistika analizo de musa duodena vilalteco (e) kaj kripto alteco (f).Diferencoj inter grupoj en Figuro 1d estis analizitaj per unudirekta ANOVA uzante SPSS-programaran version 22.0.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn ĉe *P<0.05 kaj **P<0.01.Rezultoj de sep sendependaj biologiaj eksperimentoj.ns, ne signifa (P > 0.05)
Giardia duodenum estas konata intesta parazito de homoj kaj aliaj mamuloj, kiu kaŭzas giardiazon.En 2004, ĝi estis inkludita en la Iniciato pri Neglektitaj Malsanoj de la OMS pro sia alta tropezo dum 6 jaroj, precipe en komunumoj de malalta sociekonomika statuso [32].La denaska imunsistemo ludas kritikan rolon en la imunreago al G. duodenalis-infekto.Musaj makrofagoj estis raportitaj engluti kaj mortigi G. duodenalis liberigante eksterĉelajn kaptilojn [33].Niaj antaŭaj studoj montris, ke G. duodenalis, ne-invasiva eksterĉela parazito, aktivigas p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, kaj NLRP3-inflamajn signalajn vojojn en musaj makrofagoj por reguligi gastigantajn inflamajn respondojn, kaj liberigita GEV povas plibonigi ĉi tiun procezon.13], 24].Tamen, la precizaj PAMPoj implikitaj en NLRP3-inflamsome-reguligita inflamo en GEV kaj la rolo de NLRP3-inflamsome en giardiasis restas esti pliklarigitaj.Por prilumi ĉi tiujn du demandojn, ni faris ĉi tiun studon.
La NLRP3-inflamsomo situas en la citoplasmo de imunĉeloj kaj povas esti aktivigita per diversaj partikloj kiel ekzemple uratacidaj kristaloj, toksinoj, bakterioj, virusoj kaj parazitoj.En bakteriaj studoj, toksinoj estis identigitaj kiel ŝlosilaj PAMPoj, kiuj aktivigas inflamajn sensilojn, kondukante al inflamo kaj ĉela morto [34].Kelkaj strukture diversspecaj toksinoj, kiel ekzemple hemolisino de Staphylococcus aureus [35] kaj Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) de enterotoksino (NHE) [37], induktas la aktivigon de NLRP3-inflamo.Virusaj studoj montris, ke virulecproteinoj kiel SARS-COV-2-koverto (E) proteino [38] kaj Zika-virusa NS5-proteino [39] estas gravaj PAMPoj rekonitaj de la NLRP3-receptoro.En parazitstudoj, multaj parazitoj estis raportitaj esti asociitaj kun gastiga inflammasome-aktivigo, kiel ekzemple Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], kaj Leishmania [42].La densaj grajnecaj proteinoj GRA35, GRA42 kaj GRA43, asociitaj kun la virulenco de Toxoplasma gondii, estas postulataj por la indukto de piroptozo en Lewis-rataj makrofagoj [43].Krome, iuj Leishmania-studoj koncentriĝis pri individuaj molekuloj implikitaj en la NLRP3-inflamsomo, kiel parazitmembrana lipofosfoglicano [44] aŭ zinka metaloproteazo [45].Inter la aneksin-simila alfa-giardin familio de genoj, alfa-1 giardin pruviĝis esti ebla vakcinkandidato provizanta protekton kontraŭ G. duodenalis en musmodelo [18].En nia studo, ni elektis G. duodenalis virulecfaktoroj alfa-2 kaj alfa-7,3 giardinoj, kiuj estas unikaj al giardia sed relative malpli raportitaj.Tiuj du celgenoj estis klonitaj en la pcDNA3.1(+) eŭkariota esprimsistemvektoro por analizo de inflamoaktivigo.
En nia musmodelo, fenditaj caspasaj fragmentoj funkcias kiel signoj de inflama aktivigo.Sur stimulo, NLRP3 interagas kun ASC, rekrutas prokaspasojn, kaj generas aktivajn kaspasojn kiuj fendas por-IL-1β kaj por-IL-18 en maturan IL-1β kaj IL-18, respektive -18.Inflamaj kaspasoj (caspases-1, -4, -5 kaj -11) estas konservita familio de cisteinproteazoj kiuj estas kritikaj por denaska defendo kaj estas implikitaj en inflamo kaj programita ĉela morto [46].Caspase-1 estas aktivigita de kanonikaj inflamasomoj [47], dum caspases-4, -5, kaj -11 estas fenditaj dum la formado de maltipaj inflamasomoj [48].En ĉi tiu studo, ni uzis musajn peritoneajn makrofagojn kiel modelon kaj esploris p20 caspase-1 fenditan caspase-1 kiel markilon de gastiganta NLRP3-inflama aktivigo en studoj pri G. duodenalis-infekto.La rezultoj montris, ke multaj alfa-giardinoj respondecas pri la tipa aktivigo de inflamo, kio kongruas kun la malkovro de ŝlosilaj virulecmolekuloj implikitaj en bakterioj kaj virusoj.Tamen, nia studo estas nur prepara ekrano kaj ekzistas aliaj molekuloj kiuj povas aktivigi ne-klasikaj inflamasomoj, ĉar nia antaŭa studo trovis kaj klasikajn kaj ne-klasiajn inflamasomojn en G. duodenalis-infekto [13].Por plue determini ĉu la generita p20-kaspase-1 estas rilata al la NLRP3-inflamsomo, ni transfektis alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinojn en musajn peritoneajn makrofagojn por determini ŝlosilajn molekulproteinajn esprimnivelojn kaj ASC-oligomeriznivelojn, konfirmante, ke ambaŭ α-giardinoj aktivigas. inflamasome NLRP3.Niaj rezultoj estas iomete malsamaj de tiuj de Manko-Prykhoda et al., kiuj raportis ke stimulo de Caco-2-ĉeloj kun G. muris aŭ E. coli EPEC-trostreĉoj sole povas pliigi la fluoreskecintensecon de NLRP3, ASC, kaj caspase-1, kvankam ne signife, dum kiel kunstimulado de G. muris kaj E. coli pliigis la nivelojn de tri proteinoj [49].Tiu diferenco povas ŝuldiĝi al diferencoj en la selektado de Giardia specioj, ĉellinioj, kaj primaraj ĉeloj.Ni ankaŭ faris en vivo-testojn uzante MCC950 en 5-semajnaj inaj musoj WT C57BL/6, kiuj estas pli sentemaj al G. duodenalis.MCC950 estas potenca kaj selektema malgranda molekula NLRP3-inhibitoro kiu blokas kanonan kaj ne-kanonan NLRP3-aktivigon ĉe nanomolaraj koncentriĝoj.MCC950 malhelpas NLRP3-aktivigon sed ne influas la aktivigon de AIM2, NLRC4 kaj NLRP1-inflamaj vojoj aŭ TLR-signalaj vojoj [27].MCC950 blokas NLRP3-aktivigon sed ne malhelpas NLRP3-inicon, K+-elfluon, Ca2+-enfluon, aŭ la interagadon inter NLRP3 kaj ASC;anstataŭe, ĝi malhelpas NLRP3-inflamsome-aktivigon blokante ASC-oligomerigon [27].Sekve, ni uzis MCC950 en inviva studo por determini la rolon de la NLRP3-inflamsome post injekto de giardino.Aktivigita caspase-1 p10 fendas pro-inflamatoriajn citokinojn pro-IL-1β kaj pro-IL-18 en maturajn IL-1β kaj IL-18 [50].En ĉi tiu studo, serumaj IL-1β-niveloj en musoj traktitaj kun giardino kun aŭ sen MCC950 estis utiligitaj kiel indikilo de ĉu la NLRP3-inflamsomo estis aktivigita.Kiel atendite, MCC950-traktado signife reduktis serumajn IL-1β-nivelojn.Ĉi tiuj datumoj klare pruvas, ke G. duodenalis giardin alfa-2 kaj giardin alfa-7.3 kapablas aktivigi la NLRP3-musan inflamasomon.
Signifaj datumoj akumulitaj dum la pasinta jardeko pruvis, ke IL-17A estas la majstra reguliganto de imuneco kontraŭ G. muris, induktante IL-17RA signaladon, produktante antimikrobajn peptidojn kaj reguligante komplementan aktivigon [51].Tamen, Giardia infekto okazas pli ofte en junaj plenkreskuloj, kaj estis raportite ke Giardia infekto en junaj musoj ne aktivigas la IL-17A-respondon por peni sian protektan efikon [52], instigante esploristojn serĉi alian imunomodulan Giardia.mekanismoj de infekto de helmintoj.La aŭtoroj de lastatempa studo raportis, ke G. muris povas aktivigi la NLRP3-inflamsomon de E. coli EPEC, kiu antaŭenigas la produktadon de kontraŭmikrobaj peptidoj kaj reduktas sian alligan kapablon kaj la nombron da trofozoitoj en la intesta vojo, tiel reduktante la severecon de dupunkto. malsanoj kaŭzitaj de baciloj [49].La NLRP3-inflamsomo estas implikita en la evoluo de diversaj malsanoj.Studoj montris, ke Pseudomonas aeruginosa ekigas aŭtofagion en makrofagoj por eviti ĉelmorton, kaj ĉi tiu procezo dependas de la aktivigo de la NLRP3-inflamsomo [53].Por N. caninum, reaktiva oksigena specio-mediaciita aktivigo de la NLRP3-inflamsome limigas ĝian reproduktadon en la gastiganto, igante ĝin ebla terapia celo [9].Oni trovis, ke Paracoccidioides brasiliensis induktas la aktivigon de la NLRP3-inflamsomo en musaj ostaj medolo-derivitaj dendritaj ĉeloj, rezultigante la liberigon de la inflama citokino IL-1β, kiu ludas kritikan rolon en gastiganto-defendo [10].Pluraj Leishmania specioj, inkluzive de L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, kaj L. infantum chagasi, aktivigas NLRP3 kaj ASC-dependan caspase-1 en makrofagoj, same kiel Leishmania infekton.Parazitreproduktado estas plifortigita en musoj mankhavaj en la NLRP3/ASC/caspase-1-geno [11].Zamboni et al.Leishmania infekto estis raportita stimuli aktivigon de la NLRP3-inflamazomo en makrofagoj, kiu limigas intraĉelan parazitreproduktadon.Tiel, Leishmania povas malhelpi NLRP3-aktivigon kiel evitadstrategio.En vivaj studoj, la NLRP3-inflamsomo kontribuis al la elimino de Leishmania, sed ne influis histojn [54].Male, en helmintiasis studoj, aktivigo de la NLRP3-inflamsome subpremis la protektan imunecon de la gastiganto kontraŭ gastro-intesta helmintiazo [12].Shigella estas unu el la ĉefaj bakterioj kaŭzantaj diareon tutmonde.Tiuj bakterioj povas stimuli IL-1β-produktadon per P2X7-receptor-mediaciita K+-elfluo, reaktivaj oksigenspecioj, lizozoma acidiĝo, kaj mitokondria difekto.La NLRP3-inflamsomo negative reguligas fagocitozon kaj baktericidan agadon de makrofagoj kontraŭ Shigella [55].Plasmodium-studoj montris, ke AIM2, NLRP3 aŭ caspase-1-mankaj musoj infektitaj kun Plasmodium produktas altajn nivelojn de tipo 1 interferono kaj estas pli rezistemaj al Plasmodium-infekto [56].Tamen, la rolo de alfa-2 giardine kaj alfa-7.3 giardine en induktado de patogena aktivigo de NLRP3-inflamo en musoj estas neklara.
En ĉi tiu studo, inhibicio de la NLRP3-inflamsomo de MCC950 reduktis BW kaj pliigis la nombron da trofozoitoj en intesta lavlikvaĵo en musoj, rezultigante pli severajn patologiajn ŝanĝojn en duodena histo.Alfa-2 giardino kaj alfa-7.3 giardine aktivigas la mastro-muson NLRP3-inflamsomon, pliigas musan korpan pezon, reduktas la nombron da trofozoitoj en intesta lavlikvaĵo kaj mildigas patologiajn duodenajn lezojn.Tiuj rezultoj indikas ke G. duodenalis povas aktivigi la NLRP3-gastiganinflamsomon per alfa-2 giardine kaj alfa-7,3 giardine, reduktante la patogenecon de G. duodenalis en musoj.
Kolektive, niaj rezultoj pruvas, ke alfa-2 kaj alfa-7.3 giardinoj induktas la aktivigon de la NLRP3-gastiganto-inflamsome kaj reduktas la infektecon de G. duodenalis en musoj.Tial, ĉi tiuj molekuloj estas promesplenaj celoj por la antaŭzorgo de giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: superrigardo.Lastatempe estis rivelita, ke Pat Inflamm estas alergia al drogoj.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: revizio de farmakoterapio.Faka Opinio de apotekisto.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, drogrezisto kaj la eltrovo de novaj celoj.Infektas Malordajn drogcelojn.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, ktp NLRP3 inflamasomaj kaj inflamaj malsanoj.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. La rolo de la inflamasome en intesta inflamo kaj kancero.Gastroenterologio.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanona kaj maltipa NLRP3-inflamsome-aktivigo ĉe la vojkruciĝoj de imuna toleremo kaj intestinflamo.antaŭimuna.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-mediaciita NLRP3-inflamsome-aktivigo estas implikita en respondo al N. caninum-infekto.Parazita vektoro.2020;13:449.