Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Genvektoroj por la terapio de pulma mukovisko devas esti celitaj al la konduktaj aervojoj, ĉar periferia pulmotransdukto havas neniun terapian efikon.La efikeco de virustransdukto estas rekte rilata al la restadtempo de la portanto.Tamen, liveraĵlikvaĵoj kiel ekzemple genportantoj nature difuzas en la alveolojn dum enspiro, kaj terapiaj partikloj de iu formo estas rapide forigitaj per mukociliara transporto.Plilongigi la restadtempon de genportantoj en la spira vojo estas grava sed malfacile atingi.Konjugitaj magnetaj partikloj, kiuj povas esti direktitaj al la surfaco de la spira vojo, povas plibonigi regionan celadon.Pro problemoj kun en viva bildigo, la konduto de tiaj malgrandaj magnetaj partikloj sur la aervojsurfaco en la ĉeesto de aplikata kampo estas nebone komprenita.La celo de ĉi tiu studo estis uzi sinkrotronan bildigon por bildigi en vivo la movadon de serio de magnetaj partikloj en la trakeo de anestezitaj ratoj por studi la dinamikon kaj ŝablonojn de konduto de unuopaj kaj grocaj partikloj en vivo.Ni tiam ankaŭ taksis ĉu livero de lentiviraj magnetaj partikloj en ĉeesto de kampo pliigus la efikecon de transdukto en la rattrakeo.Sinkrotrona Rentgenfota bildigo montras la konduton de magnetaj partikloj en senmovaj kaj moviĝantaj kampoj en vitro kaj en vivo.Partikloj ne povas esti facile trenitaj trans la surfacon de vivantaj aervojoj uzante magnetojn, sed dum transporto, deponaĵoj estas koncentritaj en la vidkampo, kie la magneta kampo estas plej forta.Transduktefikeco ankaŭ estis pliigita sesobla kiam lentiviraj magnetaj partikloj estis liveritaj en la ĉeesto de kampo.Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke lentiviraj magnetaj partikloj kaj kampoj povas esti valoraj aliroj por plibonigi genvektoron celadon kaj transduknivelojn en la konduktaj aervojoj en vivo.
Mukoviskozo (CF) estas kaŭzita de varioj en ununura geno nomita la CF-transmembrana kondukta reguligilo (CFTR).La CFTR-proteino estas jonkanalo kiu ĉeestas en multaj epiteliĉeloj ĉie en la korpo, inkluzive de la aervojoj, grava ejo en la patogenezo de mukoviskozo.Difektoj en CFTR kondukas al nenormala akvotransporto, dehidratiĝo de la aervojsurfaco, kaj malkreskinta aervoja surfaca fluidtavolo (ASL) profundo.Ĝi ankaŭ difektas la kapablon de la mukociliara transporto (MCT) sistemo liberigi la aervojojn de enspiritaj partikloj kaj patogenoj.Nia celo estas evoluigi lentiviran (LV) genterapion por liveri la ĝustan kopion de la CFTR-geno kaj plibonigi ASL, MCT, kaj pulmo-sanon, kaj daŭri evoluigi novajn teknologiojn kiuj povas mezuri ĉi tiujn parametrojn en vivo1.
LV-vektoroj estas unu el la plej elstaraj kandidatoj por kista fibrozo genterapio, plejparte ĉar ili povas permanente integri la terapian genon en aervojajn bazajn ĉelojn (aervojaj stamĉeloj).Ĉi tio estas grava ĉar ili povas restarigi normalan hidratiĝon kaj mukosenigon per diferenciĝado en funkciajn gen-korektitajn aervojajn surfacĉelojn asociitajn kun mukoviskozo, rezultigante dumvivajn avantaĝojn.LV-vektoroj devas esti direktitaj kontraŭ la konduktaj aervojoj, ĉar ĉi tio estas kie pulma implikiĝo en CF komenciĝas.Livero de la vektoro pli profunde en la pulmon povas rezultigi alveolaran transdukton, sed tio havas neniun terapian efikon en mukoviskozo.Tamen, fluidoj kiel ekzemple genportantoj nature migras en la alveolojn kiam enspiritaj post akuŝo3,4 kaj terapiaj partikloj estas rapide forpelitaj en la buŝkavon per MCToj.La efikeco de LV-transdukto estas rekte rilatita al la tempodaŭro, kiam la vektoro restas proksime al la celĉeloj por permesi ĉelan asimiladon - "loĝtempo" 5 kiu estas facile mallongigita per tipa regiona aerfluo same kiel kunordigita asimilado de muko kaj MCT-partikloj.Por mukoviskozo, la kapablo plilongigi LV-loĝtempon en la aervojoj estas grava por atingi altajn nivelojn de transdukto en tiu areo, sed ĝis nun estis defia.
Por venki ĉi tiun obstaklon, ni proponas, ke LV-magnetaj partikloj (MP) povas helpi en du komplementaj manieroj.Unue, ili povas esti gvidataj de magneto al la aervoja surfaco por plibonigi celadon kaj helpi genajn portantajn partiklojn esti en la ĝusta areo de la aervojo;kaj ASL) moviĝas en ĉeltavolon 6. Parlamentanoj estas vaste utiligitaj kiel laŭcelaj drog-liverveturiloj kiam ili ligas al antikorpoj, kemioterapiomedikamentoj, aŭ aliaj malgrandaj molekuloj kiuj alkroĉiĝas al ĉelmembranoj aŭ ligas al siaj respektivaj ĉelsurfacreceptoroj kaj akumuliĝas ĉe tumorlokoj en ĉeesto de statika elektro.Magnetaj kampoj por kancerterapio 7. Aliaj "hipertermaj" metodoj celas mortigi tumorajn ĉelojn per varmigado de parlamentanoj kiam ili estas eksponitaj al oscilaj magnetaj kampoj.La principo de magneta transfekto, en kiu magneta kampo estas utiligita kiel transfektagento por plifortigi la translokigon de DNA en ĉelojn, estas ofte uzita en vitro uzante gamon da ne-virusaj kaj virusaj genvektoroj por malfacile-transdukteblaj ĉellinioj. ..La efikeco de LV-magnetotransfekto kun livero de LV MP in vitro en ĉellinion de homa bronka epitelio en ĉeesto de senmova magneta kampo estis establita, pliigante la efikecon de transdukto je 186 fojojn kompare kun la LV-vektoro sole.LV MT ankaŭ estis aplikita al en vitro modelo de mukoviskozo, kie magneta transfekto pliigis LV-transdukton en aer-likvaj interfacokulturoj je faktoro de 20 en la ĉeesto de mukoviskozesputo10.Tamen, en vivo organa magnetotransfekto ricevis relative malmulte da atento kaj estis nur taksita en kelkaj bestaj studoj11,12,13,14,15, precipe en la pulmoj16,17.Tamen, la eblecoj de magneta transfekto en pulmoterapio en mukoviskozeco estas klaraj.Tan et al.(2020) deklaris, ke "validigadstudo pri efika pulma livero de magnetaj nanopartikloj pavimos la vojon por estontaj CFTR-enspirstrategioj por plibonigi klinikajn rezultojn en pacientoj kun kista fibrozo"6.
La konduto de malgrandaj magnetaj partikloj sur la surfaco de la spira vojo en ĉeesto de aplikata kampo estas malfacile bildigebla kaj studita, kaj tial ili estas malbone komprenitaj.En aliaj studoj, ni evoluigis metodon de Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) por ne-invasiva bildigo kaj kvantigado de etaj en vivo ŝanĝoj en ASL18-profundo kaj MCT19-konduto,20 por rekte mezuri gaskanalon surfachidratiĝon. kaj estas uzata kiel frua indikilo de terapiefikeco.Krome, nia MCT-poenta metodo uzas 10-35 µm-diametrajn partiklojn kunmetitajn de alumino aŭ alta refrakta indeksa vitro kiel MCT-markoj videblaj kun PB-PCXI21.Ambaŭ metodoj taŭgas por bildigi gamon da partiklospecoj, inkluzive de parlamentanoj.
Pro la alta spaca kaj tempa rezolucio, niaj PB-PCXI-bazitaj ASL kaj MCT-analizoj bone taŭgas por studi la dinamikon kaj kondutismajn ŝablonojn de unuopaj kaj pograndaj partikloj en vivo por helpi nin kompreni kaj optimumigi MP-genajn liverajn metodojn.La aliro, kiun ni uzas ĉi tie, baziĝas sur niaj studoj uzante la lumlinion SPring-8 BL20B2, en kiu ni bildigis fluidan movadon post livero de dozo de imita vektoro en la nazajn kaj pulmajn aervojojn de musoj por helpi klarigi niajn heterogenajn gen-esprimmodelojn observitajn. en nia geno.bestoj-studoj kun portanta dozo de 3,4.
La celo de ĉi tiu studo estis uzi la sinkrotronon PB-PCXI por bildigi en vivajn movojn de serio de parlamentanoj en la trakeo de vivaj ratoj.Tiuj PB-PCXI bildigaj studoj estis dizajnitaj por testi la MP-serion, magnetkampan forton, kaj lokon por determini sian efikon al MP-movado.Ni supozis, ke ekstera magneta kampo helpus la transdonitan MF resti aŭ moviĝi al la cela areo.Ĉi tiuj studoj ankaŭ permesis al ni determini magnetajn konfiguraciojn, kiuj maksimumigas la kvanton de partikloj forlasitaj en la trakeo post demetado.En dua serio de studoj, ni celis uzi ĉi tiun optimuman agordon por pruvi la transduktan ŝablonon rezultantan el en vivo livero de LV-MP-oj al la rataj aervojoj, sur la supozo, ke livero de LV-MP-oj en la kunteksto de aervoja celado rezultus. en pliigita LV-transdukta efikeco..
Ĉiuj bestoj-studoj estis faritaj laŭ protokoloj aprobitaj de la Universitato de Adelajdo (M-2019-060 kaj M-2020-022) kaj la SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.La eksperimentoj estis faritaj laŭ la rekomendoj de ARRIVE.
Ĉiuj radiografiaj bildoj estis prenitaj ĉe la BL20XU-radio ĉe la SPring-8-sinkrotrono en Japanio uzante aranĝon similan al tio priskribita antaŭe21,22.Mallonge, la eksperimenta kesto situis 245 m de la sinkrotrona stoka ringo.Provaĵo-al-detektila distanco de 0.6 m estas uzita por partiklobildigaj studoj kaj 0.3 m por en vivaj bildigaj studoj por krei fazkontrastefikojn.Monokromata trabo kun energio de 25 keV estis uzita.La bildoj estis akiritaj per alta rezolucia Rentgenfota transduktilo (SPring-8 BM3) kunligita al sCMOS-detektilo.La transduktilo transformas Rentgenradiojn al videbla lumo uzante 10 µm dikan scintilator (Gd3Al2Ga3O12), kiu tiam estas direktita al la sCMOS-sensilo uzante ×10 (NA 0.3) mikroskopcelon.La sCMOS-detektilo estis Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japanio) kun tabelgrandeco de 2048 × 2048 pikseloj kaj kruda pikselgrandeco de 6.5 × 6.5 µm.Ĉi tiu agordo donas efikan izotropan pikselan grandecon de 0.51 µm kaj vidkampon de proksimume 1.1 mm × 1.1 mm.La malkovrodaŭro de 100 ms estis elektita por maksimumigi la signalo-bruo-proporcion de magnetaj partikloj ene kaj ekster la aeraj vojoj dum minimumigo de movadaj artefaktoj kaŭzitaj de spirado.Por en vivaj studoj, rapida Rentgenfota obturatoro estis metita en la Rentgenfotan padon por limigi la radiaddozon blokante la Rentgenfotan trabon inter malkovroj.
LV-amaskomunikilaro ne estis uzita en iuj SPring-8 PB-PCXI bildigaj studoj ĉar la BL20XU bildiga kamero ne estas Biosekureca Nivelo 2 atestita.Anstataŭe, ni elektis gamon da bone karakterizitaj parlamentanoj el du komercaj vendistoj kovrantaj gamon da grandecoj, materialoj, ferkoncentriĝoj kaj aplikoj, — unue por kompreni kiel magnetaj kampoj influas la movadon de parlamentanoj en vitrokapilaroj, kaj poste en vivantaj aervojoj.surfaco.La grandeco de la parlamentano varias de 0,25 ĝis 18 µm kaj estas farita el diversaj materialoj (vidu Tabelon 1), sed la kunmetaĵo de ĉiu provaĵo, inkluzive de la grandeco de la magnetaj partikloj en la parlamentano, estas nekonata.Surbaze de niaj ampleksaj MCT-studoj 19, 20, 21, 23, 24, ni atendas, ke parlamentanoj ĝis 5 µm povas esti viditaj sur la trakea aervoja surfaco, ekzemple, subtrahante sinsekvajn kadrojn por vidi plibonigitan videblecon de MP-movado.Ununura parlamentano de 0.25 µm estas pli malgranda ol la rezolucio de la bildiga aparato, sed PB-PCXI estas atendita detekti ilian volumetran kontraston kaj la movadon de la surfaclikvaĵo sur kiu ili estas deponitaj post estado deponitaj.
Specimenoj por ĉiu parlamentano en la tabelo.1 estis preparita en 20 μl vitrokapilaroj (Drummond Microcaps, PA, Usono) kun interna diametro de 0.63 mm.Korpuskulaj partikloj estas haveblaj en akvo, dum CombiMag-partikloj estas haveblaj en la proprieta likvaĵo de la produktanto.Ĉiu tubo estas duone plenigita per likvaĵo (ĉirkaŭ 11 µl) kaj metita sur la specimenotenilon (vidu Figuro 1).La vitrokapilaroj estis metitaj horizontale sur la scenejon en la bildiga kamero, respektive, kaj poziciigitaj ĉe la randoj de la likvaĵo.19 mm diametra (28 mm longa) nikelŝela magneto farita el rara tero, neodimo, fero kaj boro (NdFeB) (N35, kat. n-ro LM1652, Jaycar Electronics, Aŭstralio) kun remanenco de 1.17 T estis alkroĉita al aparta transiga tablo por atingi Fore ŝanĝi vian pozicion dum bildigo.Rentgenfota bildigo komenciĝas kiam la magneto estas poziciigita proksimume 30 mm super la provaĵo kaj bildoj estas akiritaj je 4 kadroj je sekundo.Dum bildigo, la magneto estis alportita proksime al la vitra kapilara tubo (je distanco de proksimume 1 mm) kaj tiam movita laŭ la tubo por taksi la efikon de kampa forto kaj pozicio.
En vitro bildiga aranĝo enhavanta MP-provaĵojn en vitrokapilaroj en la stadio de tradukado de la xy-provaĵo.La vojo de la Rentgenfota trabo estas markita per ruĝa punktlinio.
Post kiam la en vitra videbleco de parlamentanoj estis establita, subaro de ili estis testita en vivo sur sovaĝ-specaj inaj Wistar-albinratoj (~12 semajnoj aĝaj, ~200 g).Medetomidino 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japanio), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japanio) kaj butorfanolo 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ratoj estis anestezitaj kun Pharma (Japanio) miksaĵo per intraperitonea injekto.Post anestezo, ili estis pretaj por bildigo forigante la felon ĉirkaŭ la trakeo, enigante endotrakean tubon (ET; 16 Ga intravejna kanulo, Terumo BCT), kaj senmovigante ilin en la supina pozicio sur specialfarita bildiga plato enhavanta termikan sakon. por konservi korpan temperaturon.22. La bilda plato estis tiam alfiksita al la specimena etapo en la bilda skatolo laŭ eta angulo por vicigi la trakeon horizontale sur la radiografia bildo kiel montrite en Figuro 2a.
(a) Enviva bildiga aranĝo en la bildiga unuo SPring-8, Rentgenfota radiovojo markita per ruĝa punktlinio.(b,c) La lokalizo de trakea magneto estis farita malproksime uzante du ortogonale muntitajn IP-fotilojn.Sur la maldekstra flanko de la bildo sur la ekrano, vi povas vidi la dratan buklon tenantan la kapon kaj la liveran kanulon instalitan ene de la ET-tubo.
Teleregata injektila pumpilsistemo (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) uzanta 100 µl-vitran injektilon estis ligita al PE10-tubo (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) uzante 30 Ga-pinglon.Marku la tubon por certigi, ke la pinto estas en la ĝusta pozicio en la trakeo kiam oni enmetas la endotrakean tubon.Uzante mikropumpilon, la injektilplonĝilo estis forigita kaj la pinto de la tubo estis mergita en la MP-provaĵo por esti liverita.La ŝarĝita livertubo tiam estis enigita en la endotrakean tubon, metante la pinton ĉe la plej forta parto de nia atendata aplikata magneta kampo.Bildakiro estis kontrolita per spirdetektilo ligita al nia Arduino-bazita tempigkesto, kaj ĉiuj signaloj (ekz., temperaturo, spirado, obturatoro malfermita/fermita, kaj bildakiro) estis registritaj uzante Powerlab kaj LabChart (AD Instruments, Sidnejo, Aŭstralio) 22 Kiam Bildigo Kiam la loĝejo ne estis disponebla, du IP-fotiloj (Panasonic BB-SC382) estis poziciigitaj proksimume 90° unu al la alia kaj uzataj por kontroli la pozicion de la magneto rilate al la trakeo dum bildigo (Figuro 2b, c).Por minimumigi moviĝartefaktojn, unu bildo per spiro estis akirita dum la fina spira flua altebenaĵo.
La magneto estas alkroĉita al la dua stadio, kiu povas situi malproksime sur la ekstera flanko de la bildiga korpo.Diversaj pozicioj kaj agordoj de la magneto estis provitaj, inkluzive de: metita laŭ angulo de proksimume 30° super la trakeo (agordoj estas montritaj en Figuroj 2a kaj 3a);unu magneto super la besto kaj la alia malsupre, kun la poloj starigitaj por altiro (Figuro 3b)., unu magneto super la besto kaj unu malsupre, kun la poloj metitaj por repuŝo (Figuro 3c), kaj unu magneto supre kaj perpendikulara al la trakeo (Figuro 3d).Post instalo de la besto kaj magneto kaj ŝarĝo de la MP sub testo en la injektilpumpilon, liveru dozon de 50 µl kun rapideco de 4 µl/sec post akiro de bildoj.La magneto tiam estas movita tien kaj reen laŭ aŭ trans la trakeon daŭrante akiri bildojn.
Magneta agordo por en viva bildigo (a) unu magneto super la trakeo laŭ angulo de proksimume 30°, (b) du magnetoj agordis por altiro, (c) du magnetoj agordis por repuŝo, (d) unu magneto supre kaj perpendikulara al la trakeo.La observanto rigardis malsupren de la buŝo ĝis la pulmoj tra la trakeo kaj la rentgenradio trapasis la maldekstran flankon de la rato kaj eliris la dekstran flankon.La magneto estas aŭ movita laŭ la longo de la aervojo aŭ maldekstre kaj dekstre super la trakeo en la direkto de la Rentgenfota trabo.
Ni ankaŭ serĉis determini la videblecon kaj konduton de partikloj en la aeraj vojoj en foresto de miksado de spirado kaj korfrekvenco.Tial, ĉe la fino de la bildiga periodo, bestoj estis humane eutanigitaj pro pentobarbita superdozo (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, Usono; ~65 mg/kg ip).Kelkaj bestoj estis lasitaj sur la bildigan platformon, kaj post la ĉeso de spirado kaj korbato, la bildiga procezo estis ripetita, aldonante plian dozon de MP se neniu MP estis videbla sur la aervoja surfaco.
La rezultaj bildoj estis korektitaj por plata kaj malhela kampo kaj tiam kunvenitaj en filmon (20 kadroj je sekundo; 15-25 × normala rapideco depende de spirofteco) uzante specialadaptitan manuskripton skribitan en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ĉiuj studoj pri LV-genvektoro-livero estis faritaj ĉe la Universitato de Adelajda Laboratory Animal Research Center kaj celis uzi la rezultojn de la SPring-8-eksperimento por taksi ĉu LV-MP-livero en la ĉeesto de magneta kampo povus plibonigi genan translokigon en vivo. .Por taksi la efikojn de MF kaj magneta kampo, du grupoj de bestoj estis traktitaj: unu grupo estis injektita per LV MF kun magnetlokigo, kaj la alia grupo estis injektita per kontrolgrupo kun LV MF sen magneto.
LV-genvektoroj estis generitaj uzante antaŭe priskribitajn metodojn 25, 26 .La LacZ-vektoro esprimas nuklean lokalizitan beta-galactosidase genon movitan fare de la MPSV konstituiga reklamanto (LV-LacZ), kiu produktas bluan reagprodukton en transduktitaj ĉeloj, videblaj sur frontoj kaj sekcioj de pulmhisto.Titrado estis farita en ĉelkulturoj permane kalkulante la nombron da LacZ-pozitivaj ĉeloj uzante hemocitometron por kalkuli la titolon en TU/ml.Portiloj estas kriokonservataj je -80 °C, degelitaj antaŭ uzo, kaj ligitaj al CombiMag per miksado 1:1 kaj kovado sur glacio dum almenaŭ 30 minutoj antaŭ la liveraĵo.
Normalaj ratoj Sprague Dawley (n = 3/grupo, ~2-3 anestezita ip kun miksaĵo de 0,4 mg/kg medetomidino (Domitor, Ilium, Aŭstralio) kaj 60 mg/kg ketamina (Ilium, Aŭstralio) je 1 monato de aĝo) ip ) injekto kaj ne-kirurgia buŝa kanulado kun 16 Ga intravejna kanulo.Por certigi, ke trakea aervoja histo ricevas LV-transdukton, ĝi estis kondiĉigita uzante nian antaŭe priskribitan mekanikan perturban protokolon, en kiu la trakea aervoja surfaco estis frotita akse per dratkorbo (N-Circle, nitinol-ŝtona ekstraktilo sen pinto NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Usono) 30 p28.Tiam, ĉirkaŭ 10 minutojn post la perturbo en la biosekureca kabineto, trakea administrado de LV-MP estis farita.
La magneta kampo uzita en ĉi tiu eksperimento estis agordita simile al en vivo-radia studo, kun la samaj magnetoj tenitaj super la trakeo per distilaj stent krampoj (Figuro 4).50 µl-volumo (2 x 25 µl alikvotoj) de LV-MP estis liverita al la trakeo (n = 3 bestoj) uzante ĝelpintan pipeton kiel priskribite antaŭe.La kontrolgrupo (n = 3 bestoj) ricevis la saman LV-MP sen la uzo de magneto.Post kompletigo de la infuzaĵo, la kanulo estas forigita de la endotrakea tubo kaj la besto estas eltubata.La magneto restas en loko dum 10 minutoj antaŭ esti forigita.Ratoj estis dozitaj subkutane kun meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Aŭstralio) sekvita de anestezoretiro per intraperitonea injekto de 1 mg/kg atipamazole klorhidrato (Antisedan, Zoetis, Aŭstralio).Ratoj estis varmigitaj kaj observitaj ĝis kompleta resaniĝo de anestezo.
LV-MP livera aparato en biologia sekureca kabineto.Vi povas vidi, ke la helgriza Luer-lock maniko de la ET-tubo elstaras el la buŝo, kaj la ĝela pipetpinto montrita en la figuro estas enigita tra la ET-tubo ĝis la dezirata profundo en la trakeon.
Unu semajnon post la administrado de LV-MP, bestoj estis humane oferitaj per enspiro de 100% CO2 kaj LacZ-esprimo estis taksita uzante nian norman X-gal-traktadon.La tri plej kaŭdalaj kartilagaj ringoj estis forigitaj por certigi, ke ajna mekanika difekto aŭ fluida reteno pro endotrakea tuballokigo ne estus inkluditaj en la analizo.Ĉiu trakeo estis tranĉita laŭlonge por akiri du duonojn por analizo kaj metita en tason enhavantan silikonkaŭĉukon (Sylgard, Dow Inc) uzante Minutien-pinglon (Fine Science Tools) por bildigi la luminalan surfacon.La distribuo kaj karaktero de la transduktitaj ĉeloj estis konfirmitaj per alfronta fotado uzante Nikon-mikroskopon (SMZ1500) per DigiLite-fotilo kaj TCapture-softvaro (Tucsen Photonics, Ĉinio).Bildoj estis akiritaj ĉe 20x pligrandigo (inkluzive de la maksimuma fikso por la plena larĝo de la trakeo), kun la tuta longo de la trakeo montrita paŝon post paŝo, disponigante sufiĉe da interkovro inter ĉiu bildo por permesi bildojn esti "kudritaj".La bildoj de ĉiu trakeo tiam estis kombinitaj en ununuran kunmetitan bildon uzante Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) uzante la planan moviĝalgoritmon. La areo de LacZ-esprimo ene de la trakeaj kunmetitaj bildoj de ĉiu besto estis kvantigita per aŭtomatigita MATLAB-skripto (R2020a, MathWorks) kiel antaŭe priskribite28, uzante agordojn de 0.35 < Hue < 0.58, Saturation> 0.15, kaj Value < 0.7. La areo de LacZ-esprimo ene de la trakeaj kunmetitaj bildoj de ĉiu besto estis kvantigita per aŭtomatigita MATLAB-skripto (R2020a, MathWorks) kiel antaŭe priskribite28, uzante agordojn de 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, kaj Valoro < 0.7. Площадь экспресси Sed Lacz в составных зображениях трахеи о к к ииииии sur ки каи к. томатизироtps. значение <0 ,7. La areo de LacZ-esprimo en kunmetitaj trakeaj bildoj de ĉiu besto estis kvantigita per aŭtomatigita MATLAB-skripto (R2020a, MathWorks) kiel antaŭe priskribite28 uzante agordojn de 0.35.0,15 kaj valoro<0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复的气管复的气管复合帟席复合帟席复合帟述进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 的 的 管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрtenas ированного сценария Matlab (R2020A, MathWorks), как описано ране, с и о н 0,5 <от 0,5 н 0. <0,7 . Areoj de LacZ-esprimo sur kunmetitaj bildoj de la trakeo de ĉiu besto estis kvantigitaj per aŭtomatigita MATLAB-skripto (R2020a, MathWorks) kiel antaŭe priskribite uzante agordojn de 0.35 < nuanco < 0.58, saturiĝo> 0.15 kaj valoro < 0.7 .Spurante histajn konturojn en GIMP v2.10.24, masko estis permane kreita por ĉiu kunmetita bildo por identigi la histan areon kaj malhelpi ajnajn malverajn detektojn ekster la trakea histo.La makulitaj areoj de ĉiuj kunmetitaj bildoj de ĉiu besto estis sumigitaj por doni la totalan makulitan areon por tiu besto.La pentrita areo tiam estis dividita per la tuta areo de la masko por akiri normaligitan areon.
Ĉiu trakeo estis enigita en parafino kaj sekcita 5 µm dika.Sekcioj estis kontraŭmakulitaj per neŭtrala rapida ruĝa dum 5 minutoj kaj bildoj estis akiritaj per mikroskopo Nikon Eclipse E400, fotilo DS-Fi3 kaj NIS-elementa kapta softvaro (versio 5.20.00).
Ĉiuj statistikaj analizoj estis faritaj en GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistika signifo estis fiksita ĉe p ≤ 0.05.Normaleco estis testita per la Shapiro-Wilk-testo kaj diferencoj en LacZ-makulado estis taksitaj per neparigita t-testo.
La ses parlamentanoj priskribitaj en Tablo 1 estis ekzamenitaj fare de PCXI, kaj la videbleco estas priskribita en Tablo 2. Du polistirenaj parlamentanoj (MP1 kaj MP2; 18 µm kaj 0.25 µm, respektive) ne estis videblaj de PCXI, sed la ceteraj provaĵoj povus esti identigitaj. (ekzemploj estas montritaj en Figuro 5).MP3 kaj MP4 estas malforte videblaj (10-15% Fe3O4; 0.25 µm kaj 0.9 µm, respektive).Kvankam MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) enhavis kelkajn el la plej malgrandaj partikloj testitaj, ĝi estis la plej okulfrapa.La produkto CombiMag MP6 estas malfacile distingebla.En ĉiuj kazoj, nia kapablo detekti MF-ojn estis multe plibonigita movante la magneton tien kaj reen paralela al la kapilaro.Ĉar la magnetoj moviĝis for de la kapilaro, la partikloj estis eltiritaj en longaj ĉenoj, sed kiam la magnetoj alproksimiĝis kaj la magnetkampa forto pliiĝis, la partikloĉenoj mallongiĝis kiam la partikloj migris al la supra surfaco de la kapilaro (vidu Suplementan Videon S1). : MP4), pliigante la partiklodensecon ĉe la surfaco.Male, kiam la magneto estas forigita de la kapilaro, la kampa forto malpliiĝas kaj la parlamentanoj rearanĝas en longajn ĉenojn etendiĝantajn de la supra surfaco de la kapilaro (vidu Suplementan Videon S2: MP4).Post kiam la magneto ĉesas moviĝi, la partikloj daŭre moviĝas dum iom da tempo post atingado de la ekvilibra pozicio.Ĉar la parlamentano moviĝas direkte al kaj for de la supra surfaco de la kapilaro, la magnetaj partikloj tendencas tiri derompaĵojn tra la likvaĵo.
La videbleco de parlamentano sub PCXI varias konsiderinde inter provaĵoj.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 kaj (d) MP6.Ĉiuj bildoj montritaj ĉi tie estis prenitaj per magneto poziciigita proksimume 10 mm rekte super la kapilaro.La ŝajnaj grandaj cirkloj estas aervezikoj kaptitaj en la kapilaroj, klare montrante la nigrajn kaj blankajn randecojn de la fazkontrasta bildo.La ruĝa skatolo indikas la pligrandigon, kiu plibonigas la kontraston.Notu ke la diametroj de la magnetcirkvitoj en ĉiuj figuroj ne estas al skalo kaj estas proksimume 100 fojojn pli grandaj ol montrite.
Ĉar la magneto moviĝas maldekstren kaj dekstren laŭ la supro de la kapilaro, la angulo de la MP-ŝnuro ŝanĝiĝas por akordigi kun la magneto (vidu Figuro 6), tiel konturante la magnetkampajn liniojn.Por MP3-5, post kiam la kordo atingas la sojlan angulon, la partikloj trenas laŭ la supra surfaco de la kapilaro.Ĉi tio ofte rezultigas parlamentanojn grupiĝantajn en pli grandajn grupojn proksime de kie la magneta kampo estas plej forta (vidu Suplementan Videon S3: MP5).Ĉi tio ankaŭ estas precipe evidenta dum bildigo proksime al la fino de la kapilaro, kiu igas la parlamentanon agregi kaj koncentriĝi ĉe la likvaera interfaco.La partikloj en la MP6, kiuj estis pli malfacile distingeblaj ol tiuj en la MP3-5, ne trenis kiam la magneto moviĝis laŭ la kapilaro, sed la MP-ŝnuroj disiĝis, lasante la partiklojn en vido (vidu Suplementan Videon S4: MP6).En kelkaj kazoj, kiam la aplikata magneta kampo estis reduktita movante la magneton longan distancon de la bildiga loko, ĉiuj ceteraj parlamentanoj malrapide descendis al la malsupra surfaco de la tubo per gravito, restante en la ŝnuro (vidu Suplementan Videon S5: MP3) .
La angulo de la MP-ŝnuro ŝanĝiĝas kiam la magneto moviĝas dekstren super la kapilaro.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 kaj (d) MP6.La ruĝa skatolo indikas la pligrandigon, kiu plibonigas la kontraston.Bonvolu noti, ke la kromaj videoj estas por informaj celoj ĉar ili malkaŝas gravan partiklan strukturon kaj dinamikajn informojn, kiuj ne povas esti bildigitaj en ĉi tiuj senmovaj bildoj.
Niaj provoj montris, ke movi la magneton tien kaj reen malrapide laŭ la trakeo faciligas la bildigon de la MF en la kunteksto de kompleksa movado en vivo.Neniuj en vivo-testoj estis faritaj ĉar la polistirenaj bidoj (MP1 kaj MP2) ne estis videblaj en la kapilaro.Ĉiu el la ceteraj kvar MFoj estis testita en vivo kun la longa akso de la magneto poziciigita super la trakeo laŭ angulo de proksimume 30° al la vertikalo (vidu Figurojn 2b kaj 3a), ĉar tio rezultigis pli longajn MF-katenojn kaj estis pli efika. ol magneto..agordo finiĝis.MP3, MP4 kaj MP6 ne estis trovitaj en la trakeo de iuj vivantaj bestoj.Vidinte la spiran vojon de ratoj post humane mortigado de la bestoj, la partikloj restis nevideblaj eĉ kiam plia volumeno estis aldonita per injektpumpilo.MP5 havis la plej altan feroksidenhavon kaj estis la nura videbla partiklo, tiel ke ĝi kutimis taksi kaj karakterizi MP-konduton en vivo.
Lokigo de la magneto super la trakeo dum MF-enmeto rezultigis multajn, sed ne ĉiujn, MFojn estantajn koncentrita en la vidkampo.Trakea eniro de partikloj estas plej bone observita en humane eutanigitaj bestoj.Figuro 7 kaj Suplementa Video S6: MP5 montras rapidan magnetan kapton kaj vicigon de partikloj sur la surfaco de la ventra trakeo, indikante ke parlamentanoj povas esti celitaj al dezirataj areoj de la trakeo.Dum serĉado pli distale laŭ la trakeo post MF-liveraĵo, kelkaj MF-oj estis trovitaj pli proksime al la carina, kiu indikas nesufiĉan magnetkampan forton por kolekti kaj teni ĉiujn MF-ojn, ĉar ili estis liveritaj tra la regiono de maksimuma magnetkampa forto dum fluida administrado.procezo.Tamen, postnaskaj MP-koncentriĝoj estis pli altaj ĉirkaŭ la bildareo, sugestante ke multaj parlamentanoj restis en aervojregionoj kie la aplikata kampoforto estis plej alta.
Bildoj de (a) antaŭ kaj (b) post livero de MP5 en la trakeon de lastatempe eutanigita rato kun magneto metita tuj super la bildiga areo.La prezentita areo situas inter du kartilagaj ringoj.Estas iom da fluido en la aeraj vojoj antaŭ ol la parlamentano estas liverita.La ruĝa skatolo indikas la pligrandigon, kiu plibonigas la kontraston.Ĉi tiuj bildoj estas prenitaj de la video prezentita en S6: MP5 Suplementa Video.
Movi la magneton laŭ la trakeo en vivo rezultigis ŝanĝon en la angulo de la MP-ĉeno sur la aervoja surfaco, simila al tio observita en kapilaroj (vidu Figuron 8 kaj Suplementan Videon S7: MP5).Tamen, en nia studo, parlamentanoj ne povus esti trenitaj laŭ la surfaco de vivantaj spiraj vojoj, kiel povus fari kapilaroj.En kelkaj kazoj, la MP-ĉeno plilongiĝas kiam la magneto moviĝas maldekstren kaj dekstren.Interese, ni ankaŭ trovis, ke la partikloĉeno ŝanĝas la profundon de la surfactavolo de la likvaĵo kiam la magneto estas movita laŭlonge laŭ la trakeo, kaj disetendiĝas kiam la magneto estas movita rekte superkape kaj la partikloĉeno estas rotaciita al vertikala pozicio (vidu. Suplementa Video S7).: MP5 je 0:09, malsupre dekstre).La karakteriza movpadrono ŝanĝiĝis kiam la magneto estis movita flanke trans la supro de la trakeo (t.e., maldekstren aŭ dekstren de la besto, prefere ol laŭ la longo de la trakeo).La partikloj ankoraŭ estis klare videblaj dum sia movado, sed kiam la magneto estis forigita de la trakeo, la pintoj de la partikloŝnuroj fariĝis videblaj (vidu Suplementan Videon S8: MP5, ekde 0:08).Tio konsentas kun la observita konduto de la kampo sub la ago de aplikata kampo en vitra kapilaro.
Ekzemplaj bildoj montrantaj MP5 en la trakeo de viva anestezita rato.(a) La magneto estas uzata por akiri bildojn super kaj maldekstre de la trakeo, tiam (b) post movi la magneton dekstren.La ruĝa skatolo indikas la pligrandigon, kiu plibonigas la kontraston.Ĉi tiuj bildoj estas de la video prezentita en la Suplementa Video de S7: MP5.
Kiam la du polusoj estis agorditaj en nord-suda orientiĝo super kaj sub la trakeo (t.e., altiri; Fig. 3b), la MP-kordoj aperis pli longaj kaj situis sur la flanka muro de la trakeo prefere ol sur la dorssurfaco de la trakeo (vidu Apendicon).Video S9:MP5).Tamen, altaj koncentriĝoj de partikloj ĉe unu loko (t.e., la dorssurfaco de la trakeo) ne estis detektitaj post fluida administrado uzante duoblan magnetan aparaton, kiu kutime okazas kun ununura magnetaparato.Tiam, kiam unu magneto estis agordita por forpuŝi kontraŭajn polusojn (Figuro 3c), la nombro da eroj videblaj en la vidkampo ne pliiĝis post livero.Agordi ambaŭ du magnetajn konfiguraciojn estas malfacila pro la alta magneta kampa forto, kiu altiras aŭ puŝas la magnetojn respektive.La aranĝo tiam estis ŝanĝita al ununura magneto paralela al la aervojoj sed pasante tra la aervojoj laŭ 90-grada angulo tiel ke la fortolinioj transiris la trakean muron ortogonale (Figuro 3d), orientiĝo intencita por determini la eblecon de partikla agregado sur la flanka muro.estu observita.Tamen, en tiu agordo, ekzistis neniu identigebla MF-akumula movado aŭ magnetmovado.Surbaze de ĉiuj ĉi tiuj rezultoj, agordo kun ununura magneto kaj 30-grada orientiĝo estis elektita por envivaj studoj de genportantoj (Fig. 3a).
Kiam la besto estis bildigita plurfoje tuj post estado humane oferita, la foresto de interrompa histomovo signifis ke pli fajnaj, pli mallongaj partiklolinioj povus esti percepteblaj en la klara interkartilaga kampo, "balanciĝantaj" laŭ la translacia moviĝo de la magneto.klare vidi la ĉeeston kaj movadon de MP6-partikloj.
La titolo de LV-LacZ estis 1.8 x 108 IU/mL, kaj post miksado 1:1 kun CombiMag MP (MP6), bestoj estis injektitaj per 50 µl de trakea dozo de 9 x 107 IU/ml de LV-veturilo (t.e. 4.5). x 106 TU/rato).).).En ĉi tiuj studoj, anstataŭ movi la magneton dum laboro, ni fiksis la magneton en unu pozicio por determini ĉu LV-transdukto povus (a) esti plibonigita kompare kun vektora livero en la foresto de kampo, kaj (b) se la aervojo povus. estu koncentrita.La ĉeloj transduktitaj en la magnetaj celregionoj de la supra spira vojo.
La ĉeesto de magnetoj kaj la uzo de CombiMag en kombinaĵo kun LV-vektoroj ne ŝajnis negative influi bestan sanon, same kiel nia norma LV-vektora livera protokolo.Frontaj bildoj de la trakea regiono submetita al mekanika perturbo (Suplementa Fig. 1) montris, ke la LV-MP traktita grupo havis signife pli altajn nivelojn de transdukto en ĉeesto de magneto (Fig. 9a).Nur malgranda kvanto da blua LacZ-makulado ĉeestis en la kontrolgrupo (Figuro 9b).Kvantigo de X-Gal-makulitaj normaligitaj regionoj montris, ke administrado de LV-MP en ĉeesto de magneta kampo rezultigis proksimume 6-oblan plibonigon (Fig. 9c).
Ekzemplo de sintezaj bildoj montrantaj trakean transdukton kun LV-MP (a) en la ĉeesto de kampo kaj (b) en la foresto de magneto.(c) Statistike signifa plibonigo en la normaligita areo de LacZ-transdukto en la trakeo kun la uzo de magneto (*p = 0.029, t-testo, n = 3 per grupo, meznombro ± norma eraro de la meznombro).
Neŭtralaj rapidaj ruĝ-makulitaj sekcioj (ekzemplo montrita en Suplementa Fig. 2) indikis, ke LacZ-makulitaj ĉeloj ĉeestis en la sama specimeno kaj en la sama loko kiel antaŭe raportite.
La ŝlosila defio en aervoja genterapio restas la preciza lokalizo de portantaj partikloj en areoj de intereso kaj la atingo de altnivela de transdukcia efikeco en la movebla pulmo en la ĉeesto de aerfluo kaj aktiva mukosenigo.Por LV-portantoj destinitaj por la traktado de spiraj malsanoj en mukoviskozo, pliigi la restadtempon de la portantaj partikloj en la konduktaj aeraj vojoj estis ĝis nun neatingebla celo.Kiel indikite fare de Castellani et al., la uzo de magnetaj kampoj por plibonigi transdukton havas avantaĝojn super aliaj genaj livermetodoj kiel ekzemple elektroporado ĉar ĝi povas kombini simplecon, ekonomion, lokalizitan liveraĵon, pliigitan efikecon, kaj pli mallongan kovadotempon.kaj eble pli malalta dozo de veturilo10.Tamen, en viva demetado kaj konduto de magnetaj partikloj en la aervojoj sub la influo de eksteraj magnetaj fortoj neniam estis priskribitaj, kaj fakte la kapablo de tiu metodo pliigi genesprimnivelojn en sendifektaj vivantaj aervojoj ne estis pruvita en vivo.
Niaj en vitro-eksperimentoj pri la PCXI-sinkrotrono montris, ke ĉiuj eroj, kiujn ni testis, escepte de la MP-polistireno, estis videblaj en la bildiga aranĝo, kiun ni uzis.En ĉeesto de magneta kampo, magnetaj kampoj formas ŝnurojn, kies longeco rilatas al la speco de partikloj kaj la forto de la magneta kampo (t.e., la proksimeco kaj movado de la magneto).Kiel montrite en Figuro 10, la ŝnuroj kiujn ni observas estas formitaj kiam ĉiu individua partiklo iĝas magnetigita kaj induktas sian propran lokan magnetan kampon.Tiuj apartaj kampoj igas aliajn similajn partiklojn kolekti kaj ligi kun grupkordmovoj pro lokaj fortoj de la lokaj fortoj de altiro kaj repuŝo de aliaj partikloj.
Diagramo montranta (a, b) ĉenojn de partikloj formiĝantaj ene de fluid-plenaj kapilaroj kaj (c, d) aerplenan trakeon.Notu ke la kapilaroj kaj trakeo ne estas desegnitaj al skalo.Panelo (a) ankaŭ enhavas priskribon de la MF enhavanta Fe3O4-partiklojn aranĝitajn en katenoj.
Kiam la magneto moviĝis super la kapilaro, la angulo de la partikloŝnuro atingis la kritikan sojlon por MP3-5 enhavanta Fe3O4, post kiu la partikloŝnuro ne plu restis en sia origina pozicio, sed moviĝis laŭ la surfaco al nova pozicio.magneto.Tiu efiko verŝajne okazas ĉar la surfaco de la vitra kapilaro estas sufiĉe glata por permesi al tiu movado okazi.Kurioze, MP6 (CombiMag) ne kondutis tiel, eble ĉar la partikloj estis pli malgrandaj, havis malsaman tegaĵon aŭ surfacan ŝargon, aŭ la proprieta portanta fluido influis ilian moviĝkapablon.La kontrasto en la CombiMag-partiklobildo ankaŭ estas pli malforta, sugestante ke la likvaĵo kaj partikloj povas havi la saman densecon kaj tial ne povas facile moviĝi unu direkte al la alia.Partikloj ankaŭ povas blokiĝi se la magneto moviĝas tro rapide, indikante ke la magnetkampa forto ne ĉiam povas venki la froton inter partikloj en la likvaĵo, sugestante ke la magneta kampoforto kaj la distanco inter la magneto kaj la celareo ne devus esti kiel. surprizo.grava.Tiuj rezultoj ankaŭ indikas ke kvankam magnetoj povas kapti multajn mikropartiklojn fluantajn tra la celareo, estas neverŝajne ke magnetoj povas esti fidi sur por movi CombiMag-partiklojn laŭ la surfaco de la trakeo.Tiel, ni konkludis, ke en vivo LV MF-studoj devus uzi senmovajn magnetajn kampojn por fizike celi specifajn areojn de la aervoja arbo.
Post kiam la partikloj estas liveritaj en la korpon, ili malfacilas identigi en la kunteksto de la kompleksa kortuŝa histo de la korpo, sed ilia detektkapablo estis plibonigita movante la magneton horizontale super la trakeo por "svingi" la MP-ŝnurojn.Dum realtempa bildigo estas ebla, estas pli facile distingi partiklomovon post kiam la besto estis humane mortigita.MP-koncentriĝoj estis kutime plej altaj ĉe tiu loko kiam la magneto estis poziciigita super la bildiga areo, kvankam kelkaj partikloj estis kutime trovitaj pli malsupren la trakeo.Male al en vitro studoj, partikloj ne povas esti trenitaj laŭ la trakeo per la movado de magneto.Tiu trovo estas kongrua kun kiel la muko kiu kovras la surfacon de la trakeo tipe prilaboras enspiritajn partiklojn, kaptante ilin en la muko kaj poste malbarante ilin tra la muko-ciliara senigmekanismo.
Ni hipotezis, ke uzi magnetojn super kaj sub la trakeo por altiro (Fig. 3b) povus rezultigi pli unuforman magnetan kampon, prefere ol magneta kampo kiu estas tre koncentrita ĉe unu punkto, eble rezultigante pli unuforman distribuadon de partikloj..Tamen, nia prepara studo ne trovis klaran indicon por subteni ĉi tiun hipotezon.Simile, fiksi paron da magnetoj por repuŝi (Fig. 3c) ne rezultigis pli da partiklo ekloĝanta en la bildareo.Ĉi tiuj du trovoj pruvas, ke la du-magneta aranĝo ne signife plibonigas la lokan kontrolon de MP-indikado, kaj ke la rezultaj fortaj magnetaj fortoj malfacilas agordi, igante ĉi tiun aliron malpli praktika.Simile, orienti la magneton super kaj trans la trakeo (Figuro 3d) ankaŭ ne pliigis la nombron da partikloj restantaj en la bildigita areo.Kelkaj el tiuj alternativaj konfiguracioj eble ne estas sukcesaj ĉar ili rezultigas redukton en la magnetkampa forto en la demetzono.Tiel, la ununura magneta agordo je 30 gradoj (Fig. 3a) estas konsiderita la plej simpla kaj plej efika en vivo-testmetodo.
La LV-MP-studo montris, ke kiam LV-vektoroj estis kombinitaj kun CombiMag kaj liveritaj post estado fizike ĝenitaj en la ĉeesto de kampo, transduktaj niveloj pliiĝis signife en la trakeo kompare kun kontroloj.Surbaze de sinkrotronbildaj studoj kaj LacZ-rezultoj, la magneta kampo ŝajnis povi konservi la LV en la trakeo kaj redukti la nombron da vektoraj partikloj kiuj tuj penetris profunde en la pulmon.Tiaj celaj plibonigoj povas konduki al pli alta efikeco dum redukto de liveritaj titoloj, ne-celata transdukto, inflamaj kaj imunaj kromefikoj, kaj genaj translokaj kostoj.Grave, laŭ la fabrikanto, CombiMag povas esti uzata en kombinaĵo kun aliaj genaj translokaj metodoj, inkluzive de aliaj virusvektoroj (kiel AAV) kaj nukleaj acidoj.